检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸，均涉及检测用上游引物LAPTM4B

【技术实现步骤摘要】
检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于生物科学和生物
，特别涉及一种检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，用于检测肿瘤患者体内LAPTM4B基因的表达水平。

技术介绍

[0002]溶酶体四次跨膜蛋白质B(lysosome
‑
associated protein transmembrane 4B，LAPTM4B)是由北京大学周柔丽教授等人通过荧光差异显示技术筛选出的一种新型癌基因，在87.3％的原发性肝癌中超高表达，与肝癌的增殖/分化、病理分级和转移/预后密切相关，而在成人正常肝组织中低表达或几乎不表达。
[0003]LAPTM4B基因位于染色体8q22.1，长约50kb，共有7个外显子和6个内含子。cDNA全长含有2245个核苷酸，具有一个开放阅读框(ORF)，氨基酸序列含4个跨膜区，3个N糖基化位点，8个磷酸化位点，4个酯酰化位点，N端和C端均具有数个可被SH3结构域识别并与之结合的Pro富集区，C端胞质尾部具有多个保守基序结构3个“YXXφ”(Y为酪氨酸，x为任一氨基酸残基，φ中为疏水性氨基酸残基)。现已证明LAPTM4B mRNA广泛表达于一些正常组织中：睾丸、心脏、骨骼肌和子宫组织中表达较高；而在肺和外周血中表达较低。
[0004]研究表明LAPTM4B基因编码的蛋白与肿瘤特性及生物学行为密切相关，可能作为原癌基因在恶性肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。研究指出，位于转录起始点上游558bp的一段DNA是LAPTM4B基因的核心启动子，转录因子SP1参与了LAPTM4B基因启动子区的转录调节，可能与LAPTM4B在肝癌的高表达有关。LAPTM4B在人肝细胞癌组织中表达显著升高，并且分化越低，表达水平越高，在中分化肝癌、正常肝组织中度表达，在高分化肝癌、癌旁组织和正常成人肝组织低水平表达。
[0005]有研究指出，在肝癌细胞系中应用阿霉素——用于诱导细胞凋亡，发现LAPTM4B过表达组的肝癌细胞凋亡率较低，这说明LAPTM4B能够抑制细胞凋亡。LAPTM4B除了能促进肿瘤细胞的生长增殖、抑制细胞凋亡之外，LAPTM4B与肿瘤化疗耐药也密切相关。在BT549细胞中应用RNAi抑制LAPTM4的表达，发现LAPTM4B表达降低的细胞对蒽环、多柔比星和柔红霉素的敏感度增高。另外，过表达LAPTM4B可以增加细胞对化疗药物(如紫杉醇和\顺铂)的外排作用。综上所述，LAPTM4B可能作为癌症耐药的新靶点。
[0006]综上研究所述，LAPTM4B基因在肝癌患者中表达升高。采用相关措施使LAPTM4B基因表达水平下调，可增加肝癌患者对部分化疗药物的敏感性。随着对LAPTM4B基因表达水平与影响肝癌患者预后研究的深入，将为利用LAPTM4B基因表达对肝癌进行危险分层、预后评估及疗效评价提供理论依据。
[0007]检测LAPTM4B等基因表达水平的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时定量PCR技术(RQ
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PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。RQ
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PCR采用
Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。

技术实现思路

[0008]本专利技术设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因Actin和目的基因LAPTM4B的定量标准曲线，检测目的基因LAPTM4B相对于内参基因Actin的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够实现对LAPTM4B基因表达水平的检测，用于评价治疗效果、预测预后。
[0009]本专利技术提供用于检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测用上游引物LAPTM4B
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F、下游引物LAPTM4B
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R和检测用探针LAPTM4B
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Probe，其碱基序列如下所示：
[0010]LAPTM4B
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F：TGGTTGCAATCACTGTGCTTATT
[0011]LAPTM4B
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R：CATGACATCATCTCTGTAGGGAAAA
[0012]LAPTM4B
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Probe：FAM
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CCAAACTCCATTCAGGAATACATACGGCAA
‑
TAMRA。
[0013]进一步地，所述寡核苷酸还包括针对内参基因Actin的上游引物Actin
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F、下游引物Actin
‑
R和探针Actin
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Probe，其碱基序列如下所示：
[0014]Actin
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F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0015]Actin
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R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0016]Actin
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Probe：FAM
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ACCACCACGGCCGAGCGG
‑
TAMRA。
[0017]本专利技术还提供一种检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算LAPTM4B基因相对表达量，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测用上游引物LAPTM4B
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F、下游引物LAPTM4B
‑
R、检测用探针LAPTM4B
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Probe以及针对内参基因Actin的上游引物Actin
‑
F、下游引物Actin
‑
R和探针Actin
‑
Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：
[0018]LAPTM4B
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F：TGGTTGCAATCACTGTGCTTATT
[0019]LAPTM4B
‑
R：CATGACATCATCTCTGTAGGGAAAA
[0020]LAPTM4B
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Probe：FAM
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CCAAACTCCATTCAGGAATACATACGGCAA
‑
TAMRA；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括检测用上游引物LAPTM4B
‑
F、下游引物LAPTM4B
‑
R和检测用探针LAPTM4B
‑
Probe，其碱基序列如下所示：LAPTM4B
‑
F：TGGTTGCAATCACTGTGCTTATTLAPTM4B
‑
R：CATGACATCATCTCTGTAGGGAAAALAPTM4B
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Probe：FAM
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CCAAACTCCATTCAGGAATACATACGGCAA
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TAMRA。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括针对内参基因Actin的上游引物Actin
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F、下游引物Actin
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R和探针Actin
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Probe，其碱基序列如下所示：Actin
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F：TGAGCGAGGCTACAGCTTActin
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R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin
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Probe：FAM
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ACCACCACGGCCGAGCGG
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TAMRA。3.一种检测样本中LAPTM4B基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算LAPTM4B基因相对表达量，其特征在于，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测用上游引物LAPTM4B
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F、下游引物LAPTM4B
‑
R、检测用探针LAPTM4B
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Probe以及针对内参基因Actin的上游引物Actin
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F、下游引物Actin
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R和探针Actin
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Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：LAPTM4B
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F：TGGTTGCAATCACTGTGCTTATTLAPTM4B
‑
R：CATGACATCATCTCTGTAGGGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，刘赵玲，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：