一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的方法技术

本发明专利技术提供一种一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的方法。针对市场上用鸡肉、兔肉下脚料经过加工冒充猪肉的现象，需要一个统一的检测方法，以鉴别生鲜猪肉、鸡肉和兔肉，以及混合或加工过的肉制品中该三种肉的成分。传统的检测方法检测时间长，耗时费力，本发明专利技术以猪肉、鸡肉和兔肉的线粒体细胞色素b基因为特征靶基因设计3对特异性引物：F/R猪、F/R鸡和F/R兔，通过PCR得到特异性扩增片段，分析电泳图中是否出现目标条带，进而检测肉样是否掺假。该方法能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别鸭肉、鸡肉、兔肉以及混合或加工过的肉品中的这三种肉的成分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品质量安全检测
，涉及一种一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的PCR技术检测方法。
技术介绍
我国是一个肉类消费大国，肉类是我国居民食物源中的一个极为重要的类别。近年来，随着人们生活水平的提高，肉类市场也急剧扩大，不法商贩在利益的驱使下，掺假事件频频发生。目前，掺假的手段主要是以假乱真，例如有些商家在商品中掺杂异种肉，如用鸡肉、兔肉及其下脚料等冒充猪肉制成饺子馅等等，肉类食品掺假已成为影响我国食品质量安全的又一大问题。因此，对肉类进行快速、准确的检测以确定是否掺假显得十分重要。然而传统方法操作复杂、耗时耗力，对样品要求高而不能满足肉类鉴定快速、精确的要求。因此，亟需建立一套简单、快速、准确、可靠、特异性高的现代化检测方法。以核酸为基础的鉴定方法，特别是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术正逐步成为肉类食品鉴定的主要分析方法。曾经提出或使用过的方法，如红外线光谱检测、蛋白质指纹方法、免疫学方法、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)和扩增片段长度多态性分析(AFLP)等均存在某些缺点，如检测结果不稳定、难以区分混合肉样、操作繁琐等。本专利技术利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列，通过尝试截短引物、设计通用上游引物，优化反应条件等多种策略，经过反复试验，开发出了一种可一次性、快速准确鉴别食品中猪肉、鸡肉和兔肉三种成分的检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种简单、快速、低成本、高效可靠的快速检测肉类掺假的方法。本专利技术首先提供一种用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的PCR引物组，引物组中引物的信息如下：用于鉴别猪肉的引物组，其上游引物的序列为TAGGAGACCCAGAHAACT(SEQ ID NO:1)；下游引物的核苷酸序列为TAGGAAGTATAAGATGGAG(SEQ ID NO:2)；用于鉴别鸡肉的引物组，其上游引物的序列为TAGGAGACCCAGAHAACT
(SEQ ID NO:1)，下游引物的序列为GAGGACTGAGGCTGCT(SEQ ID NO:3)；用于鉴别兔肉的引物组，其上游引物的序列为TAGGAGACCCAGAHAACT(SEQ ID NO:1)；下游引物的序列为AAGGACCATGAGGTCGG(SEQ ID NO:4)；上述的引物组用于制备用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的制品；本专利技术另一个方面提供一种鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的方法，是使用上述的引物组进行PCR扩增检测鉴定。上述的方法，其一种操作步骤如下：1)提取检测样品的DNA提取待检测样品的DNA作为检测用的模板2)PCR扩增25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水；PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min；3)电泳分析和观察PCR扩增反应结束后，将扩增产物与6×Loading Buffer混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。本专利技术所建立的一种一次性快速鉴别猪、鸡、兔肉的PCR技术检测方法，其中根据猪、鸡、兔肉线粒体细胞色素b基因所设计的3对特异性引物，其扩增出的条带特异性明显，能有效检测出掺假肉品种类，且引物数量较传统方法大为减少，从而减少了假阳性的出现。该方法准确、可靠、简单快捷，可用于混合或加工食品中肉类种属的筛选和肉类掺假的检测和监管。附图说明图1为猪、鸡、兔的标准PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3为分别加入猪、鸡、兔引物后的PCR扩增条带；泳道4：阴性对照；图2为实施例2～4的PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3、泳道4～6、泳道7～9分别为实施例2～4的PCR扩增条带；泳道1～9依次为加入猪、鸡、兔、
兔、猪、鸡、兔、猪、鸡引物后的PCR扩增条带；图3为实施例5～6的PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3、泳道4～6分别为实施例5～6的PCR扩增条带；泳道1～6依次为加入兔、猪、鸡、兔、猪、鸡引物后的PCR扩增条带；泳道7：阴性对照；图4为实施例7的PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3依次为加入猪、鸡、兔引物后的PCR扩增条带。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的分析。实施例1：扩增引物的筛选首先对PCR反应中最重要的引物进行设计，并对所设计的引物的检测灵敏度进行验证筛选。1)引物设计选用种属间特异性差异明显的线粒体细胞色素b基因作为靶基因，同时，为了既实现一次性鉴别出鸡肉、兔肉和猪肉3个物种的目的，又减少实验中所加入引物的数量，首先确定各组物种的细胞色素b基因的高度保守区，然后在各物种的高度保守区中找出彼此的差异区，在差异区设计特异性引物组。利用Oligo 6.0，Primer5.0，DNAMAN等软件设计多组引物，要求退火温度大致相同，这样才能实现一次PCR反应能够扩增出3条目的条带，并在预实验中设计引物特异性试验、模板之间的交叉试验来进行筛选；确定了几组待筛选的引物组。2)灵敏度检验对设计的几组引物进行检测灵敏度的筛选，首先是设置3组鸡肉/兔肉/猪肉的梯度比例，分别为10g/10g/100g、1g/1g/100g和0.1g/0.1g/100g，将三者充分混匀后用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份200mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品，然后进行PCR扩增，所用的25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，鉴别猪肉、鸡肉或兔肉的引物组2μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；最后
72℃延伸10min。所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。最后确定了能检测出鸡肉或兔肉当掺杂量低至0.1g/0.1g/100g的引物组(在实际的制售掺假肉环节，1g/100g的掺假廉价肉对于商贩来说无利可图，因此检测限已足够低。)最终所筛选出的引物组，其引物的信息如下：猪：F-TAGGAGACCCAGAHAACT；(H＝A/C)(SEQ ID NO:1)R猪-TAGGAAGTATAAGATGGAG；(SEQ ID NO:2)鸡：F-TAGGAGACCCAGAHAACT；(SEQ ID NO:1)R鸡-GAGGACTGAGGCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中用于鉴别猪肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1，下游引物的序列为SEQ ID NO:2；用于鉴别鸡肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1，下游引物的序列为SEQ ID NO:3；用于鉴别兔肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1；下游引物的序列为SEQ ID NO:4。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中用于鉴别猪肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1，下游引物的序列为SEQ ID NO:2；用于鉴别鸡肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1，下游引物的序列为SEQ ID NO:3；用于鉴别兔肉的引物组，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1；下游引物的序列为SEQ ID NO:4。2.权利要求1所述的引物组在制备用于鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的制品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为试剂盒。4.一种鉴别猪肉、鸡肉、兔肉的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增检测鉴定。5.如权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙海新，于金鑫，孙丕春，张慧，范忠刚，
申请(专利权)人：山东世通检测评价技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37