一种牛奶产品中头孢类药物残留的多联检测方法技术

本发明专利技术属于动物源性食品中药物残留的检测技术领域，是一种用高效液相色谱仪测定牛奶产品中头孢类药物残留量的方法。包括样品预提取、标准曲线绘制、仪器检测分析步骤，所述检测方法为使用高效液相色谱进行的一种多联检测方法，同时检测的药物包括头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩。本发明专利技术对头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩等4种头孢类药物的检出限为分别为0.26mg/Kg、0.01mg/Kg、0.10mg/Kg、0.07mg/Kg；在1mg/kg～50mg/kg添加浓度范围内线性关系良好，回收率为90％～105％；本方法的批内相对标准偏差≤15％，批间相对标准偏差≤20％。本发明专利技术具有分析时间短、检测限低、精密度高、多联检测的优点，对于准确监控牛奶中头孢类药物残留量具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种牛奶产品中头孢类药物残留的多联检测方法
本专利技术属于动物源性食品中药物残留的检测
，是一种用高效液相色谱仪测定牛奶产品中头孢类药物残留量的方法。
技术介绍
随着我国畜牧业的快速发展，兽药在降低畜禽发病率和致死率、促进动物生产、改善动物肉制品品质和提高饲料利用率方面起到了显著的作用，已成为现代畜牧业的重要支撑。头孢菌素类(Cephalosporins)属于β-内酰胺类抗生素，具有耐青霉素酶、疗效高、毒性低、过敏反应少、抗菌谱广等特点，可有效抑制细菌的生长和繁殖。在畜牧动物养殖中，头孢类抗生素广泛用于奶牛乳房炎的预防与治疗，动物尿道、胃肠道及呼吸道等的细菌病的治疗和防治。但是在实际养殖过程中，由于使用方法的不规范，不但造成动物源细菌病原的耐药性上升，引发超剂量用药的恶性循环，而且导致畜产品中的药物残留量的积累，引起食品安全隐患，给人类带来过敏、肠道菌群失调、耐药性上升等严重危害。因此，中国农业部明确规定(农业部560号公告)：“头孢哌酮等人医临床控制使用的最新抗菌药物用于食品动物，会产生耐药性问题，影响动物疫病控制、食品安全和人类健康，予以注销产品批准文号，不得再生产、经营和使用。”目前对头孢类兽药残留的检测方法多为针对单个药物的检测，不适应对目前多种头孢类兽药进行监控，因此，建立一种准确、稳定的多联检测方法对于实现该类药物的有效监控具有重要意义。中国专利(CN200910085945.7)公开了一种检测头孢类药物的酶联免疫试剂盒及其应用，通过酶联免疫法对头孢类兽药残留进行检测，只能通过吸光值粗略判断残留量，抗体制备步骤繁琐，检出限高，不易用作精确定量检测。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种定量检测牛奶产品中头孢类抗生素残留的多联检测方法，满足对畜牧临床领域禁用的头孢类抗生素的多联检测需求。本专利技术对头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩等4种头孢类药物的检出限为分别为0.26mg/kg、0.01mg/Kg、0.10mg/kg、0.07mg/Kg；在1mg/kg～50mg/kg添加浓度范围内线性关系良好，回收率为90％～105％；本方法的批内相对标准偏差≤15％，批间相对标准偏差≤20％。本专利技术的技术方案是一种检测牛奶中头孢类抗生素的多联检测方法，包括样品预提取、标准曲线绘制、仪器检测分析步骤，所述检测方法为使用高效液相色谱进行的一种多联检测方法，同时检测的药物包括头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩，具体包括如下步骤：(1)样品预提取：称取牛奶样品置于离心管中，加入蛋白清除剂，超声波处理后离心，吸取上清液至试管中，氮气吹干，加入与样品等体积的甲醇-0.1％甲酸溶液复溶，加入脂肪清除剂去除脂肪，振荡，离心，弃去正己烷后液体经有机滤膜过滤后转移至棕色瓶中，备用；优选为称取牛奶样品置于离心管中，加入乙腈，超声波处理，5000rpm离心10min，吸取上清液至试管中，氮气吹干，加入与样品等体积甲醇-0.1％甲酸溶液复溶，加入正己烷去除脂肪，振荡，5000rpm离心10min，弃去正己烷，经有机滤膜过滤后转移至棕色瓶中，备用；(2)标准溶液配制及标准曲线的绘制：取标准工作液，用甲醇-0.1％甲酸溶液进行不同倍数稀释，绘制标准曲线；优选为分别准确称取头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩标准品各100mg，用甲醇-0.1％甲酸溶解并定容到4个10mL棕色容量瓶中配制成单标准品溶液，再分别吸取适量单标准品溶液转移至1个10mL棕色容量瓶中精确定容，配制成浓度为1mg/mL的混合标准品储备溶液。再用甲醇-0.1％甲酸溶液将混合标准品溶液经适当稀释，配制成浓度分别为0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.050mg/mL的混合标准品工作液，采用高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线，计算标准回归方程；(3)将步骤(1)所得样品进高效液相色谱仪器检测，将检测结果与所述标准曲线对比得到待测物浓度。优选条件为采用Agilent1100型高效液相色谱仪；Agilent(C18，4.6x250，5μm)ZORBAXEclipsePlus反相色谱柱；流动相为A-甲醇，B-0.1％甲酸溶液，A∶B(体积比)＝3∶7～4∶6；检测波长为254nm；流速为1ml/min；柱温为35℃；进样量为20μl。进一步的，所述步骤(1)中的超声波处理方法为间歇式，超声波处理5秒，间歇5秒，60个循环。进一步的，所述步骤(1)中的蛋白清除剂为乙腈，样品液与乙腈的体积比为1∶3～1∶4。进一步的，所述步骤(1)中的脂肪清除剂为正己烷，样品液与正己烷的体积比为2∶1～2.5∶1。进一步的，所述甲醇-0.1％甲酸溶液，甲酸与0.1％甲酸的体积比为3∶7～4∶6。进一步的，所述步骤(1)中的有机滤膜为两步过滤，即先经0.45μm有机滤膜过滤，滤过液再经0.22μm有机滤膜过滤。可有效去除样品中干扰物质，缩短处理时间，提高效率。进一步的，所述样品为液态纯奶产品或者奶粉产品。本专利技术的检测流程如下：(1)样品预处理称取5g牛奶样品，精确至0.01g，将样品置于离心管中，加入15～20mL乙腈，超声波振荡，即超声5秒，间隔5秒，60个循环，5000rpm离心10min，取上清液，吸取上清液至试管中，氮气吹干，加入甲醇-0.1％甲酸溶液(V/V3∶7～4∶6)复溶，加入2～2.5mL正己烷除脂，振荡，5000rpm离心10min，弃去正己烷，先后经0.45μm和0.22μm滤膜过滤后进高效液相色谱仪分析。(2)检测条件设定条件为采用Agilent1100型高效液相色谱仪；Agilent(C18，4.6x250，5μm)ZORBAXEclipsePlus反相色谱柱；流动相为A-甲醇，B-0.1％甲酸溶液，A∶B(体积比)＝3∶7～4∶6；检测波长为254nm；流速为1ml/min；柱温为35℃；进样量为20μl。(3)标准曲线绘制分别准确称取头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩标准品各100mg，用甲醇-0.1％甲酸溶解并定容到4个10mL棕色容量瓶中配制成单标准品溶液，再分别吸取适量单标准品溶液转移至1个10mL棕色容量瓶中精确定容，配制成浓度为1mg/mL的混合标准品储备溶液。再用甲醇-0.1％甲酸溶液将混合标准品溶液经适当稀释，配制成浓度分别为0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.050mg/mL的混合标准品工作液，采用高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线，计算标准回归方程。(4)将步骤1所得样品经高效液相色谱仪器检测，将检测结果与所述标准曲线对比得到待测物检测结果。(5)空白实验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。(6)结果测定①定性测定在同样测试条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5％以内。②定量测定取试样溶液和相应的标准工作液，作多点校准，按外标法以峰面积定量。标准溶液及试样溶液中的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。③结果计算和表述按式(a)计算试样中头孢类抗生素的残留量：式中：X-试样中头孢类抗生素的残留量，mg/kg；C-试样溶液中头孢类抗生素的浓度，μg/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛奶产品中头孢类药物残留的多联检测方法，包括样品预提取、标准曲线绘制、仪器检测分析步骤，其特征在于：所述检测方法为使用高效液相色谱进行的一种多联检测方法，同时检测的药物包括头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩。

【技术特征摘要】
1.一种牛奶产品中头孢类药物残留的多联检测方法，其特征在于，所述的方法同时检测的药物包括头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩；该方法包括以下步骤：(1)样品预提取：称取牛奶样品置于离心管中，加入蛋白清除剂，超声波处理后离心，吸取上清液至试管中，氮气吹干，加入与样品等体积的甲醇-0.1％甲酸溶液复溶，加入脂肪清除剂去除脂肪，振荡，离心，弃去正己烷后液体经有机滤膜过滤后转移至棕色瓶中，备用；(2)标准溶液配制及标准曲线的绘制：取标准工作液，用甲醇-0.1％甲酸溶液进行不同倍数稀释，绘制标准曲线；(3)将步骤(1)所得样品进高效液相色谱仪器检测，将检测结果与所述标准曲线对比得到待测物浓度；所述步骤(2)中的高效液相色谱的参数如下：采用Agilent1100型高效液相色谱仪；Agilent(C18,4.6x250,5μm)ZORBAXEclipsePlu...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙海新，黄金发，张慧，许娜，孙丕春，
申请(专利权)人：山东世通检测评价技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37