本发明专利技术公开了一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法，所述方法为使用1对目标片段引物和2对分段引物，进行2轮PCR扩增，将扩增结果测序后与标准株进行比对，获得恶性疟原虫DHPS基因点突变的结果。本发明专利技术还公开了基于所述检测方法的试剂盒。本发明专利技术能够准确地检测出恶性疟原虫DHPS基因点突变，对于监测抗疟药的药效有着非常重要的意义。
A method and kit for detecting point mutation of DHPs gene of Plasmodium falciparum
【技术实现步骤摘要】
一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法及其试剂盒
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法及其引物和试剂盒。
技术介绍
疟疾是一种严重威胁人类生命健康的寄生虫传染病。尽管世界各国在控制和消除疟疾方面做出了很大努力，但是疟疾依然是威胁世界大约50%人口的重大传染病。根据世界卫生组织发布的《世界疟疾报告2018》，2017年全球疟疾病例为2.19亿，导致438000人死亡。其中，恶性疟病情严重、死亡率高，并且恶性疟原虫已经对多种抗疟药产生耐药性。疟原虫红内期不能利用环境中的叶酸和四氢叶酸，必须以磷酸喋啶、对氨基苯甲酸为原料，在二氢蝶酸合成酶（Dihydrofolatesynthetase，DHPS）作用下形成二氢蝶酸，进一步与谷氨酸生成二氢叶酸，接着在二氢叶酸还原酶的作用下转变成四氢叶酸后，才能够参与疟原虫核酸的形成。抗叶酸合成类药物可以通过竞争结合机制抑制二氢叶酸合成及二氢叶酸向四氢叶酸转变，从而抑制DNA复制、减少甲硫氨酸合成，最终使疟原虫因生长受阻而死亡。以磺胺多辛为代表的磺胺类药物是氨基苯磺酰胺衍生物，因其与对氨基苯甲酸产生竞争性抑制作用，所以能够取代对氨基苯甲酸从而阻断二氢叶酸的合成，起到抗疟作用。由于恶性疟原虫对氯喹产生严重的抗药性，磺胺多辛和乙胺嘧啶联合使用作为替代氯喹的经济有效药物之一，在许多国家作为一线治疗药物使用。但是随着该药物的广泛使用，疟原虫尤其是恶性疟原虫对该药物的抗药性也随之出现并迅速传播。恶性疟原虫DHPS基因点突变使靶酶活性中心结构域形状改变，这种改变降低了对磺胺多辛药物的敏感性。检测恶性疟原虫DHPS基因点突变对于监测恶性疟原虫磺胺多辛药物抗性情况以及合理配伍用药十分重要。为此，我们研发一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法以及基于该方法的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法，所述方法包括以下步骤。（1）以恶性疟原虫基因组DNA为模板，使用1对目标片段引物进行第1轮PCR扩增，得到所述DHPS基因的目标片段扩增产物。（2）以第1轮PCR扩增产物为模板，将所述DHPS基因目标片段分为2个子片段，使用2对分段引物对所述子片段进行第2轮PCR扩增，得到所述DHPS基因的两部分片段扩增产物。（3）将所述第2轮PCR扩增产物进行测序，与恶性疟原虫标准株3D7序列进行比对，找出相应的点突变。本专利技术的第二目的在于提供一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变方法的试剂盒，所述试剂盒包含含3个子试剂盒：1个子试剂盒包含1对目标引物，另2个子试剂盒分别包含1对分段引物。附图说明图1为DHPS基因SN目标片段扩增结果示意图；图中，M表示100bpDNAladder（TakaRa），1-6是SN目标片段扩增产物，长度为546bp。图2为DHPS基因SD目标片段扩增结果示意图；图中，M表示100bpDNAladder（TakaRa），1-6是SD目标片段扩增产物，长度为564bp。图3恶性疟原虫DHPS基因1845位置碱基多态T/G（S436A）。图4恶性疟原虫DHPS基因1849位置碱基多态G/C（G437A）。图5恶性疟原虫DHPS基因2157位置碱基多态A/G（K540E）。图6恶性疟原虫DHPS基因2281位置碱基多态C/G（A581G）。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所做的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法，包括如下步骤。（1）以恶性疟原虫基因组DNA为模板，使用1对目标片段引物进行第1轮PCR扩增，得到所述DHPS基因的目标片段扩增产物。（2）以第1轮PCR扩增产物为模板，将所述DHPS基因目标片段分为2个子片段，使用2对分段引物对所述子片段进行第2轮PCR扩增（使用分段引物分别进行1次PCR扩增，因此第2轮实际上包括2两次PCR扩增），得到所述DHPS基因的两部分片段扩增产物。（3）将所述第2轮PCR扩增产物进行测序，与恶性疟原虫标准株3D7序列进行比对，找出相应的点突变。恶性疟原虫DHPS基因突变与磺胺多辛药物抗性相关的位点主要有5个，对应的密码子分别是S436A、G437A、K540E/N、A581G、A613S/T，在基因中的起始位置范围是1845~2378。为覆盖所有突变位点，本专利技术选择PCR扩增的目标片段起始位置范围为1608~2517，以恶性疟原虫标准株3D7序列为模板，依据各个突变位点的位置信息，设计适合的目标片段引物和分段引物。目标片段引物序列如下所示：上游引物为5’-GTGAGTAGGATGAAAGAACAATA-3’(SEQIDNo.1)；下游引物为5’-GATCCTTGTCTTTCCTCATG-3’(SEQIDNo.2)。将目标片段分为2个子片段，1608~2153为一段；1954~2517为另一段；为了便于区分，将前者称为“SN片段”，将后者称为“SD片段”。为确保序列的完整性，所以两个子片段有200bp的重叠部分。针对两个子片段，分别设计分段引物，序列如下所示：SN片段的上游引物为5’-GTGAGTAGGATGAAAGAACAATA-3’(SEQIDNo.1)；SN片段的下游引物为5’-CATTGTATGTGGATTTCCTCT-3’(SEQIDNo.3)；SD片段的上游引物为5’-AATGTGATGCGAAACCAAT-3’(SEQIDNo.4)；SD片段的下游引物为5’-GATCCTTGTCTTTCCTCATG-3’(SEQIDNo.2)。由于SN和SD段加起来就是目标片段，因此，上下游各有1条引物与目标片段引物相同。作为本专利技术的一种优选，PCR扩增方法为巢式PCR扩增方法。第1、2轮的3次PCR扩增的反应体系相同，总体积均为50µL：PremixTaq（TaKaRaTaqVersion2.0plusdye）25µL，上游引物（10µM）0.5µL，下游引物（10µM）0.5µL，1µL模板DNA，23µLddH2O。3次PCR扩增的反应条件均为：95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃退火30s，68℃延1min，34个循环；68℃延伸5min，4℃保存。本专利技术还提供了一种基于检测恶性疟原虫DHPS基因点突变方法的检测试剂盒，所述试剂盒包含3个子试剂盒：1个子试剂盒包含1对目标引物，另2个子试剂盒分别包含1对分段引物。本专利技术可快速、准确地检测出恶性疟原虫DHPS基因的点突变位点，用于评价恶性疟原虫对磺胺多辛药物的敏感情况，并为疟疾流行区的合理用药提供科学的建议。下面将结合具体实施例，对本专利技术进行进一步的说明。实施例1：第1轮PCR扩增。在缅甸西部疟疾流行地区采集恶性疟疾患者血样。取50份滤纸血斑样品，按照QIAamp®DNAMicroKit（QIAGEN）操作手册和滤纸血斑样品提取方法，提取恶性疟原虫基因组DNA。PCR扩增反应体系总体积为50µL：PremixTaq（TaKaRaTaqVersion2.0plusdye）25µL，上游引物（10µM）0.5µL，下游引物（10µM）0.5µL，1µL模板DNA，23µLd本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测恶性疟原虫
【技术特征摘要】
1.一种检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以恶性疟原虫基因组DNA为模板，使用1对目标片段引物进行第1轮PCR扩增，得到所述DHPS基因的目标片段扩增产物；（2）以第1轮PCR扩增产物为模板，将所述DHPS基因目标片段分为2个子片段，使用2对分段引物对所述子片段进行第2轮PCR扩增，得到所述DHPS基因的两部分片段扩增产物；（3）将所述第2轮PCR扩增产物进行测序，与恶性疟原虫标准株3D7序列进行比对，找出相应的点突变。2.根据权利要求1所述检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法，其特征在于，所述PCR扩增为巢式PCR扩增方法。3.根据权利要求1所述检测恶性疟原虫DHPS基因点突变的方法，其特征在于，所述目标引物的上游引物序列如S...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴艳瑞，杨照青，赵路旖，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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