基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法技术

本发明专利技术公开一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记，DNA序列如SEQ ID NO：1所示；上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示；鉴定方法依次按照如下步骤进行：分离鱼体病灶部位组织提取组织DNA；进行PCR扩增；用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，若出现498 bp的电泳条带，病灶部位寄生的盾纤毛虫即为水滴伪康纤虫，具有快速、简单和准确等优点。

Molecular markers, primers and methods of PCR based identification of pseudodefibrillator

【技术实现步骤摘要】
基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法
本专利技术属于生物
，尤其是一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法。
技术介绍
水滴伪康纤虫（Pseudocohnilembuspersalinus）是盾纤毛虫的代表种，隶属于盾纤目，纤毛虫类，是个体微小的兼性寄生纤毛虫，已被公认为是海水养殖鱼类的主要盾纤类病原体。水滴伪康纤虫适应性极强，可自由生活于各种养殖水体中，一旦养殖水体中因残饵过多、环境恶化等导致有机物含量过高，水滴伪康纤虫将大量繁殖并寄生于各养殖周期鱼体，尤其是体表损伤的鱼体。该寄生虫以宿主的细胞或组织碎片为食，严重时患病鱼体继发细菌性疾病，导致养殖鱼类大量死亡。为此当虫害发生时，需要对寄生于宿主体表的虫子进行鉴定，以便根据不同种类准确施药。然而，由于盾纤类寄生虫活体形态十分相似，在光学显微镜及扫描电镜下均难以区分（附图1、2、3、4），即使借助18SrDNA技术测定核糖体序列，因盾纤类的序列相似度相对较高（达到90%以上），使得盾纤毛虫定种难度较大。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法。本专利技术的技术解决方案是：一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记，其特征在于DNA序列如SEQIDNO：1所示。一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的引物，其特征在于上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示。一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.取患病鱼体表盾纤毛虫寄生病灶部位组织提取DNA；b.按照下列条件进行PCR扩增：PCR反应体系为40μL体系：KODbuffer20μL，2mMdNTPs8μL，上游引物及下游引物各2μL，2μL，KOD酶0.8μL，盾纤毛虫DNA2μL，灭菌蒸馏水5.2μL；所述游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示；PCR反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性15s，56℃退火30s，68℃延伸45s，35个循环；68℃延伸5min；c.用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，若出现498bp的电泳条带，所分离得到的盾纤毛虫即为水滴伪康纤虫。本专利技术确定了基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记并设计了鉴定引物，只需进行一次PCR扩增，即可准确地鉴定出盾纤毛虫的代表病原—水滴伪康纤虫，具有快速、简便及准确等优点。附图说明图1是水滴伪康纤虫在光学显微镜下观察结果。图2是海洋尾丝虫在光学显微镜下观察结果。图3是水滴伪康纤虫扫描电镜观察结果。图4是海洋尾丝虫扫描电镜观察结果。图5是本专利技术实施例以被测鱼体组织DNA为模板进行PCR扩增结果电泳图。图6以海洋尾丝虫DNA和水滴伪康纤虫DNA为模板进行PCR扩增结果电泳图。具体实施方式本专利技术的技术解决方案是：一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记，是通过测定水滴伪康纤虫（Pseudocohnilembuspersalinus）的线粒体全基因组，分析水滴伪康纤虫种内相对保守基因，盾纤毛虫种间差异基因而确定的，DNA序列如SEQIDNO：1所示。以所确定的基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记设计的引物，上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示。基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的方法，依次按照如下步骤进行：a.用无菌接种环刮取患病鱼体表盾纤毛虫寄生病灶部位组织不小于20mg，用海洋生物组织DNA提取试剂盒提取组织DNA；b.按照下列条件进行PCR扩增：PCR反应体系为40μL体系：KODbuffer20μL，2mMdNTPs8μL，上游引物及下游引物各2μL，2μL，KOD酶0.8μL，盾纤毛虫DNA2μL，灭菌蒸馏水5.2μL；所述游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示；PCR反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性15s，56℃退火30s，68℃延伸45s，35个循环；68℃延伸5min；c.用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果如图5所示。图5中M：Marker；泳道1出现498bp的电泳条带。PCR扩增产物经测序公司测序后，DNA序列如SEQIDNO：1所示。对比例1：1.分别以通过形态学和18SrDNA测序分析确定的海洋尾丝虫DNA和水滴伪康纤虫DNA为标准模板进行PCR扩增，其PCR反应体系及PCR反应条件同本专利技术实施例；2.将所得PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。图6中M：Marker；泳道1：海洋尾丝虫DNA为模板；泳道2：水滴伪康纤虫DNA为模板。从图6可以看出，海洋尾丝虫DNA为模板的PCR产物电泳条带为空，而水滴伪康纤虫DNA为模板的PCR扩增产物，得到498bp清晰条带。PCR扩增产物经测序公司测序后，DNA序列如SEQIDNO：1所示。通过对比验证可以看出，本专利技术所确定的基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法，可以快速、简单和准确地鉴定水滴伪康纤虫。序列表<110>大连海洋大学<120>基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>498<212>DNA<213>人工序列(Pseudocohnilembuspersalinus)<400>1tgactcttcactaaaaatgtgaggtcaaactgatttaaaaaagttagttgcttatggtac60aatccaagaaatgaatttaatttttttagttttttgttgaggtgatacaaatgctatagt120tggtggtattctttttaccgcaactcactcttttttatcagcattaatgttttttttagt180cgattgtatttacagaaggtaccatacaagatctttaatagaggttaatggtattttaca240tatgactccaaatttaggtatagctattttagtaatgacagttttcttttcagggttacc300tggaactataaaatatattacagaattttatatctttagtggtttcttagaaacttctgt360tttttcttgcttttttttaatgtttgttgctaatgttctaggtttaataggatttagtaa420atgttgatttaatgcagtttttggtatgatgagaaaacatgttggtactataccacttga480tttaacaattaaggaatt498<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列(Pseudocohnilembuspersalinus)<220><221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>2gttatggttacaatgtttggtgttat26<210&g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记，其特征在于DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记，其特征在于DNA序列如SEQIDNO：1所示。2.一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的引物，其特征在于上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示。3.一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.取患病鱼体表盾纤毛虫寄生病灶部位组织提取DNA；b.按照下列条件进行PCR扩增：PCR反应体系为40μL体系：KODbuffer20μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎睿君，黄宇希，高延奇，
申请(专利权)人：大连海洋大学，黎睿君，
类型：发明
国别省市：辽宁,21