结合测定制造技术

描述了用于测定包含淋巴细胞活化基因‑3(LAG‑3)蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHC II类结合活性的方法。所述方法包括使用生物层干涉术(BLI)测定所述LAG‑3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHC II类分子的结合。所述方法可以用作所述化合物的良好生产规范(GMP)级生产中的质量控制测定。还描述了用于进行所述方法的探针和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合测定相关申请的交叉引用本申请要求申请号为201611180971.4、标题为“结合测定”、在2016年12月19日提供于中国专利局的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
本专利技术涉及用于测定淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白或其片段、衍生物或类似物制剂的MHCII类结合活性的方法，以及用于所述方法中的探针和试剂盒。
技术介绍
LAG-3蛋白是具有四个细胞外免疫球蛋白超家族结构域的CD4I同源型膜蛋白。与CD4相似，LAG-3在T细胞的表面处低聚化，并且结合抗原递呈细胞(APC)上的MHCII类分子，但具有比CD4显著更高的亲和力。LAG-3在活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞上表达，其中它与细胞表面处的CD3/T细胞受体复合物缔合并且负向调节信号转导。因此，它负向调节T细胞增殖、功能和体内平衡。与效应或记忆T细胞相比，LAG-3在耗竭的T细胞上被上调。LAG-3也在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上被上调，并且使用抗LAG-3抗体阻断LAG-3可以增强抗肿瘤T细胞应答。IMP321是重组的、可溶性LAG-3Ig融合蛋白，其以高亲合力结合MHCII类。它是靶向MHCII类阳性抗原递呈细胞(APC)的第一类免疫增强剂(Fougeray等：AsolubleLAG-3proteinasanimmunopotentiatorfortherapeuticvaccines:PreclinicalevaluationofIMP321.Vaccine2006,24:5426-5433；Brignone等：IMP321(sLAG-3)safetyandTcellresponsepotentiationusinganinfluenzavaccineasamodelantigen:Asingle-blindphaseIstudy.Vaccine2007,25:4641-4650；Brignone等：IMP321(sLAG-3),animmunopotentiatorforTcellresponsesagainstaHBsAgantigeninhealthyadults:asingleblindrandomisedcontrolledphaseIstudy.JImmuneBasedTherVaccines2007,5:5；Brignone等：Asolubleformoflymphocyteactivationgene-3(IMP321)inducesactivationofalargerangeofhumaneffectorcytotoxiccells.JImmunol2007,179:4202-4211)。IMP321已在先前治疗的晚期肾细胞癌患者中测试，已知在通过3个月之内的重复注射所治疗的所有患者中，IMP321是免疫抑制性的并且显示出诱导循环活化的CD8T细胞和长寿命的效应记忆CD8T细胞的百分比增加，而没有任何可检测的毒性(Brignone等：AphaseIpharmacokineticandbiologicalcorrelativestudyofIMP321,anovelMHCclassIIagonistinpatientswithadvancedrenalcellcarcinoma.ClinCancerRes2009,15:6225-6231)。仅几个ng/mL浓度的IMP321已显示在体外对APC是具有活性的，这显示了IMP321作为免疫系统的激动剂的巨大潜力(Brignone,等,2009,同上)。在转移性乳腺癌(MBC)患者的研究中，Brignone等(First-linechemoimmunotherapyinmetastaticbreastcarcinoma:combinationofpaclitaxelandIMP321(LAG-3Ig)enhancesimmuneresponsesandantitumoractivity.JournalofTranslationalMedicine2010,8:71)证明IMP321使IMP321结合的初级靶细胞(MHCII类阳性单核细胞/树突细胞)和随后被活化的次级靶细胞(NK/CD8+效应记忆T细胞)两者扩增并且活化数个月。通过汇集来自所有30名患者的结果并且将肿瘤消退与适当的历史对照组进行比较，他们看到客观应答率加倍，这表明IMP321在此临床环境中是有效的抗癌细胞免疫应答的强力激动剂。WO99/04810描述了LAG-3蛋白或其片段或衍生物作为佐剂用于疫苗接种，和在癌症治疗中的用途。LAG-3蛋白或其片段或衍生物用于治疗癌症和感染性疾病的用途描述于WO2009/044273中。考虑到LAG-3及其片段或衍生物的医学用途，存在对提供符合优良生产规范(GMP)的所述化合物的制剂的需要。所述规范是需要的以便符合控制活性药物产品的授权和生产许可以及销售的机构所推荐的指导方针。这些指导方针提供药品制造商必须满足的最低要求，以确保产品质量高，并且不会对消费者或公众构成任何风险。作为蛋白质的GMP级制造中的质量控制程序的一部分，有必要确定所述化合物的制剂是否保持高水平的生物活性。然而，我们已发现，用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的若干种常规方法不适于测定LAG-3衍生物IMP321与在免疫细胞表面上表达的MHCII类分子的特异性结合。具体地说，荧光活化细胞分选法(FACS)不适于区分具有结合MHCII类表达细胞的不同能力的IMP321制剂。对于使用FACS获得的结合曲线，在IMP321浓度增加时没有观察到上平台。这阻止了对不同制剂的相对效力的计算，所述计算需要收敛的平台(平行度)。我们还已发现，IMP321非特异性结合用于MesoScaleDiscovery(MSD)电致化学发光(ECL)测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)的板。虽然通过使用酪蛋白作为封闭试剂使IMP321与用于ELISA和MSD测定的板的非特异性结合显著降低，但是这降低了MSD测定中的绝对信号。对于使用其中表达MHCII类分子的细胞被固定到MSD板的测定法所获得的结合曲线，没有观察到上平台。还测试了不同的ELISA技术，其中将表达MHCII类分子的细胞在IMP321结合后转移至另一个板，以便最小化IMP321与板的非特异性结合的影响。然而，发现孔与孔的信号变化是不可接受的。鉴于此，结论是，在用于测试GMP级产品的质量控制测定中，MSDECL测定或ELISA测定均不能用于测定IMP321与固定化细胞的特异性结合。因此，需要提供一种用于测定LAG-3蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHCII类结合活性的适合用作所述化合物的GMP级生产中的质量控制测定的方法。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了一种用于测定包含淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHCII类结合活性的方法，其中所述方法包括使用生物层干涉术(BLI)测定LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHCII类分子的结合。术语“生物层干涉术(BLI)”在本文中用于指基于相移干涉术的光纤测定，例如如美国专利号5,804,453(Chen)中所述。对BLI技术的开发，包括旨在增强分析物检测的灵敏度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于测定包含淋巴细胞活化基因‑3(LAG‑3)蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHC II类结合活性的方法，其中所述方法包括使用生物层干涉术(BLI)测定所述LAG‑3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHC II类分子的结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.19 CN 20161118097141.一种用于测定包含淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHCII类结合活性的方法，其中所述方法包括使用生物层干涉术(BLI)测定所述LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHCII类分子的结合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实施方法包括测定所述LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHCII类表达细胞上存在的MHCII类分子的结合。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物被固定化到BLI探针的试剂层，并且所述MHCII类表达细胞是在溶液中的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述MHCII类表达细胞可以至少1E6/mL，优选至少4E6/mL或8E6/mL的密度存在。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述试剂层已用封闭试剂预处理以最小化所述MHCII类表达细胞与所述试剂层的非特异性结合。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述封闭试剂包括白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA)。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述MHCII类表达细胞是Raji细胞。8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述MHCII类表达细胞是从冷冻储备溶液获得的解冻的、即用型细胞。9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括针对多种不同浓度的所述LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物，测定所述LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物与所述MHCII类分子的结合速率，以及产生针对所述结合速率的剂量-应答曲线。10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在与用于测定所述制剂的所述LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物的结合相同的条件下，通过使用BLI测定参比样品的所述LAG-3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHCII类分子的结合来测定LAG-3蛋白或其片段、衍生物或类似物的所述参比样品的MHCII类结合活性，并且将针对所述参比样品测定的所述MHCII类结合活性与针对所述制剂测定的所述MHCII类结合活性进行比较。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，贾晓青，
申请(专利权)人：伊缪泰普有限公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR