测定制造技术

描述了用于筛选淋巴细胞活化基因3(LAG

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测定
[0001]本专利技术涉及用于筛选淋巴细胞活化基因3(LAG
‑
3)的激动剂或确定其活性(包括确定其制剂的效力)的测定。本专利技术还涉及用于进行所述测定的试剂盒。
[0002]T细胞功能的刺激是在T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC I类或II类分子(CD8 T细胞为MHC I，CD4 T细胞为MHC II)所呈递的短肽相互作用后起始的。在原代T细胞中，TCR本身不能活化下游通路以起始T细胞的活化。这还需要辅助受体，诸如用于辅助性T细胞的CD4和用于细胞毒性T细胞的CD8。这些辅助受体结合其相应的MHC分子并稳定T细胞和APC的相互作用。除了TCR与抗原负载MHC结合之外，辅助性T细胞和细胞毒性T细胞均需要一些次级信号以充分活化并作出反应。在辅助性T细胞的情况下，这些中的第一个由CD28提供。这种蛋白质为在APC上表达的两种分子(CD80和CD86)的受体，并且起始T细胞增殖，导致对抗原具有特异性的T细胞克隆的扩增。细胞毒性T细胞的活化不太依赖CD28，但确实需要其他共刺激分子(诸如CD70和CD137)的信号。
[0003]TCR位于信号传导分子的复合物附近，其通过多个信号级联介导T细胞活化(TCR信号传导的概述参见图1)。这些信号传导分子包括CD3蛋白家族。一旦TCR与肽
‑
MHC复合物正确接合，便诱导相关CD3链的构象变化，从而导致其磷酸化并与下游蛋白质缔合。TCRζ链在TCR接合时也被磷酸化。这些分子由Src激酶、白细胞特异性酪氨酸激酶(LCK)和Fyn通过其C末端免疫受体酪氨酸活化基序(mmunoreceptor Tyrosine
‑
based Activation Motif；ITAM)进行磷酸化。
[0004]磷酸化的CD3 ITAM招募并活化Syk家族激酶ζ活化蛋白70kDa(ZAP70)。然后，ZAP70将称为T细胞活化的接头(Linker for Activation of T cell；LAT)的膜相关支架蛋白磷酸化。LAT继而招募第二分子支架，76kDa的含SH2结构域白细胞蛋白(Slp
‑
76)。然后，Slp
‑
76被ZAP70磷酸化，并且得到的LAT
‑
Slp
‑
76复合物充当用于招募信号传导效应分子的支架。然后，白介素
‑
2诱导性酪氨酸激酶(ITK)与LAT
‑
Slp
‑
76复合物相互作用并通过自磷酸化(auto
‑
phosphorylation)而被活化。这促进了效应分子磷脂酶Cγ(PLC
‑
γ1)的磷酸化。PLC
‑
γ1通过切割质膜中的三磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)以生成第二信使二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)来转导TCR信号。
[0005]DAG为膜相关脂质，活化一些下游蛋白质，包括蛋白激酶C(PKC)和RAS鸟苷酸释放蛋白(RasGRP)的各种同工型。被DAG活化之后，PKC
‑
θ参与活化NF
‑
κB通路，而RasGRP为MAPK信号传导通路的关键活化剂。IP3刺激Ca
2+
从内质网流出到细胞质中。Ca
2+
水平升高诱导蛋白质磷酸酶钙调磷酸酶的活化，然后钙调磷酸酶使T细胞转录因子活化T细胞核因子(NFAT)去磷酸化。然后，去磷酸化的NFAT迁移到细胞核，加入其他转录因子，诱导特定基因的转录。
[0006]对病原体或自身抗原的不受控制的免疫反应可造成炎性组织损伤和自身免疫疾病。为了防止这种情况，免疫反应通过共刺激信号与抑制信号(统称为免疫检查点)之间的平衡来调控，它们是维持自身耐受并保护宿主免受组织损伤所必需的。活化的T细胞表达多种共抑制受体，诸如淋巴细胞活化基因3(LAG
‑
3)、程序性细胞死亡蛋白1(PD
‑
1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA
‑
4)以及T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序[ITIM]结构域(TIGIT)。已显示，抑制性免疫检查点受体调节T细胞对自身蛋白以及对慢性感染和
肿瘤抗原的反应。抑制性免疫检查点受体由于它们有可能用于多种类型的癌症而成为癌症免疫疗法的靶标。
[0007]LAG
‑
3为CD4同源I型膜蛋白，具有四个细胞外Ig超家族结构域。与CD4相似，LAG
‑
3在T细胞表面寡聚并与APC上的MHC II类分子结合，但亲和力显著高于CD4。LAG
‑
3在活化的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上表达，在那里它与细胞表面的CD3
‑
TCR复合物缔合并负调控信号转导。因此，它负调控T细胞增殖、功能和稳态。当特定的TCR识别MHC II类
‑
肽复合物时，细胞内信号通过TCR在T细胞中转导并通过MHC II类分子在APC中转导。向T细胞中的LAG
‑
3信号传导的负调控作用在原代CD4
+
和CD8
+
人类T细胞反应中起作用(等人,Immunology.2005年6月；115(2):170
‑
178)。然而，LAG
‑
3负调控T细胞中的信号转导的分子机制尚不清楚。LAG
‑
3的抑制性功能需要其细胞内(IC)区域，但此区域不含有具有已知信号传导机制的典型信号传导基序。Maeda等人(J.Biol.Chem.2019,RA119.007455)最近报道了，LAG
‑
3通过近膜区域中的FxxL基序和C末端的EX重复序列转导两个独立的抑制性信号。然而，这些基序先前没有关于抑制性辅助受体的报道，并且LAG
‑
3转导的抑制性信号的分子机制仍然难以确定。
[0008]WO 2017/037203描述了作为LAG
‑
3激动剂的抗体(诸如人源化单克隆抗体IMP761)及其抗原结合片段以及它们治疗与CD4
+
和/或CD8
+ T细胞的增殖和/或活化有关的疾病、特别是炎性和自身免疫疾病的用途。
[0009]用于测量抗体和其他设计成靶向免疫检查点受体的药物的活性的传统方法依赖于原代人类细胞以及功能终点(诸如细胞增殖、细胞表面标志物表达和细胞因子产生)的测量。由于依赖供体原代细胞、测定方案复杂并且检测试剂不合格，所以这些测定费力并且变化很大。因此，这些测定难以在质量控制的药物开发环境中建立。为了解决这些困难，Promega公司针对个别和组合免疫检查点免疫疗法靶标开发了基于细胞的生物发光报道蛋白生物测定(Cheng等人,2016年6月,Promega,“Quantitative Cell
‑
Based Bioassays for Indivisual and Combination Immune Che本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定淋巴细胞活化基因3(LAG
‑
3)激动剂的活性的体外测定，其包括：提供多个效应T细胞，每个效应T细胞在其表面上表达LAG
‑
3和T细胞受体(TCR)并且包括编码报道蛋白的报道基因，其中所述报道蛋白的表达通过所述效应T细胞内LAG
‑
3介导的对TCR信号传导的抑制来调控；以及根据在存在所述激动剂的情况下所述报道蛋白的表达与在不存在所述激动剂的情况下所述报道蛋白的表达相比所改变的程度，确定所述激动剂的活性。2.根据权利要求1所述的测定，其用于确定LAG
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3激动剂制剂的效力。3.一种用于筛选LAG
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3激动剂的体外测定，其包括：提供多个效应T细胞，每个效应T细胞在其表面上表达LAG
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3和T细胞受体(TCR)并且包括编码报道蛋白的报道基因，其中所述报道蛋白的表达通过所述效应T细胞内LAG
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3介导的对TCR信号传导的抑制来调控；以及通过确定在存在候选激动剂的情况下所述报道蛋白的表达与在不存在所述候选激动剂的情况下所述报道蛋白的表达相比所改变的程度来确定所述候选激动剂是否为LAG
‑
3激动剂。4.根据权利要求1或2所述的测定，其中所述报道蛋白在不存在所述激动剂的情况下在所述效应T细胞中以基础水平表达，或者根据权利要求3所述的测定，其中所述报道基因在不存在所述候选激动剂的情况下在所述效应T细胞中以基础水平表达。5.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中与在不存在所述激动剂或候选激动剂的情况下报道蛋白的表达相比，在存在所述激动剂或候选激动剂的情况下所述报道蛋白的表达降低。6.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中响应于经由所述TCR的所述效应T细胞的活化，每个效应T细胞中所述报道蛋白的表达均改变，并且所述测定还包括：在存在和不存在所述激动剂或候选激动剂的情况下，通过抗原非依赖性、MHC II类非依赖性、TCR介导的T细胞活化来活化所述效应T细胞；以及根据在存在所述激动剂或候选激动剂的情况下响应于所述效应T细胞的活化的所述报道蛋白的表达与在不存在所述激动剂或候选激动剂的情况下响应于所述效应T细胞的活化的所述报道蛋白的表达相比所改变的程度，确定所述激动剂或所述候选激动剂的活性。7.根据权利要求6所述的测定，其中由于所述效应T细胞内LAG
‑
3介导的对TCR信号传导的抑制，所述报道蛋白的表达在每个效应T细胞中响应于经由所述TCR的所述效应T细胞的活化而增加并且在存在所述激动剂或候选激动剂的情况下减少，并且其中根据在存在所述激动剂或候选激动剂的情况下响应于所述效应T细胞的活化的所述报道蛋白的表达与在不存在所述激动剂或候选激动剂的情况下响应于所述效应T细胞的活化的所述报道蛋白的表达相比所减少的程度，确定所述激动剂或所述候选激动剂的活性。8.根据权利要求6或7所述的测定，其中通过使所述效应T细胞与抗原非依赖性、MHC II类非依赖性T细胞活化剂在用于所述效应T细胞被所述T细胞活化剂抗原非依赖性、MHC II类非依赖性、TCR介导地活化的条件下接触来活化所述效应T细胞。9.根据权利要求8所述的测定，其中所述效应T细胞与所述T细胞活化剂接触，所述T细胞活化剂的浓度为在存在过量LAG
‑
3激动剂的情况下对所述报道蛋白的表达产生最大抑制的浓度。
10.根据权利要求8或9所述的测定，其中所述效应T细胞与所述T细胞活化剂接触，所述T细胞活化剂的浓度低于在不存在所述激动剂或候选激动剂的情况下观察到响应于所述效应T细胞被所述T细胞活化剂活化而所述报道蛋白的表达最大时所述T细胞活化剂的浓度。11.根据权利要求8至10中任一项所述的测定，其中所述T细胞活化剂包括以下或由以下组成：抗CD3抗体或其保留抗原非依赖性、MHC II类非依赖性、TCR介导的效应T细胞活化能力的片段或衍生物。12.根据权利要求11所述的测定，其中所述抗CD3抗体为OKT3。13.根据权利要求11或12所述的测定，其中所述抗CD3抗体或其片段或衍生物与所述效应T细胞接触的浓度为约6
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30x10
‑
12
M(完整抗体为1
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4ng/ml，或者其片段或衍生物为摩尔当量)。14.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中所述效应T细胞通过无细胞、抗原非依赖性、MHC II类非依赖性、TCR介导的T细胞活化来活化。15.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中所述效应T细胞与若干不同浓度的所述激动剂或候选激动剂接触。16.根据权利要求15所述的测定，其还包括针对抑制所述报道蛋白的表达，确定所述激动剂或候选激动剂的IC
50
值。17.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中所述效应T细胞包括有包括所述报道基因的异源核酸。18.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中所述报道基因处于启动子或反应元件的控制之下。19.根据权利要求18所述的测定，其中所述反应元件包括NFAT(活化T细胞核因子)反应元件(NFAT
‑
RE)。20.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中所述报道蛋白包括生物发光报道蛋白，例如荧光素酶。21.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其中所述效应T细胞包括编码LAG
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3的异源核酸。22.根据前述权利要求中任一项所述的测定，其还包括进行阴性...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德里克，
申请(专利权)人：伊缪泰普有限公司，
类型：发明
国别省市：