结合测定制造技术

描述了用于测定包含淋巴细胞活化基因

【技术实现步骤摘要】
and IMP321(LAG
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3Ig)enhances immune responses and antitumor activity.Journal of Translational Medicine 2010,8:71)证明IMP321使IMP321结合的初级靶细胞(MHC II类阳性单核细胞/树突细胞)和随后被活化的次级靶细胞(NK/CD8+效应记忆T细胞)两者扩增并且活化数个月。通过汇集来自所有30名患者的结果并且将肿瘤消退与适当的历史对照组进行比较，他们看到客观应答率加倍，这表明IMP321在此临床环境中是有效的抗癌细胞免疫应答的强力激动剂。
[0007]WO 99/04810描述了LAG
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3蛋白或其片段或衍生物作为佐剂用于疫苗接种，和在癌症治疗中的用途。LAG
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3蛋白或其片段或衍生物用于治疗癌症和感染性疾病的用途描述于WO 2009/044273中。
[0008]考虑到LAG
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3及其片段或衍生物的医学用途，存在对提供符合优良生产规范(GMP)的所述化合物的制剂的需要。所述规范是需要的以便符合控制活性药物产品的授权和生产许可以及销售的机构所推荐的指导方针。这些指导方针提供药品制造商必须满足的最低要求，以确保产品质量高，并且不会对消费者或公众构成任何风险。作为蛋白质的GMP级制造中的质量控制程序的一部分，有必要确定所述化合物的制剂是否保持高水平的生物活性。
[0009]然而，我们已发现，用于测定蛋白质
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蛋白质相互作用的若干种常规方法不适于测定LAG
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3衍生物IMP321与在免疫细胞表面上表达的MHC II类分子的特异性结合。具体地说，荧光活化细胞分选法(FACS)不适于区分具有结合MHC II类表达细胞的不同能力的IMP321制剂。对于使用FACS获得的结合曲线，在IMP321浓度增加时没有观察到上平台。这阻止了对不同制剂的相对效力的计算，所述计算需要收敛的平台(平行度)。
[0010]我们还已发现，IMP321非特异性结合用于MesoScale Discovery(MSD)电致化学发光(ECL)测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)的板。虽然通过使用酪蛋白作为封闭试剂使IMP321与用于ELISA和MSD测定的板的非特异性结合显著降低，但是这降低了MSD测定中的绝对信号。对于使用其中表达MHC II类分子的细胞被固定到MSD板的测定法所获得的结合曲线，没有观察到上平台。还测试了不同的ELISA技术，其中将表达MHC II类分子的细胞在IMP321结合后转移至另一个板，以便最小化IMP321与板的非特异性结合的影响。然而，发现孔与孔的信号变化是不可接受的。鉴于此，结论是，在用于测试GMP级产品的质量控制测定中，MSD ECL测定或ELISA测定均不能用于测定IMP321与固定化细胞的特异性结合。
[0011]因此，需要提供一种用于测定LAG
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3蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHC II类结合活性的适合用作所述化合物的GMP级生产中的质量控制测定的方法。

技术实现思路

[0012]根据本专利技术，提供了一种用于测定包含淋巴细胞活化基因
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3(LAG
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3)蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHC II类结合活性的方法，其中所述方法包括使用生物层干涉术(BLI)测定LAG
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3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHC II类分子的结合。
[0013]术语“生物层干涉术(BLI)”在本文中用于指基于相移干涉术的光纤测定，例如如美国专利号5,804,453(Chen)中所述。对BLI技术的开发，包括旨在增强分析物检测的灵敏度和准确性的开发，描述于ForteBio公司的WO 2005/047854和WO 2006/138294中。
[0014]US 5,804,453描述了用于检测结合光纤端表面的分析物探针、方法和系统。分析物检测是基于由分析物分子与表面的结合产生的光纤端表面处的厚度变化的，其中更大量
的分析物产生干涉信号的更大的与厚度相关的变化。干涉信号的变化归因于从光纤端部反射的光与从光纤端部上携带的结合层反射的光之间的相移，如US 5,804,453的图7a和图7b中具体示出的。
[0015]US 5,804,453中描述的探针包括具有近端尖端和远端尖端的光纤部分以及设置在远端尖端上的试剂层。试剂层与被检测的物质(分析物)反应(或键合)。光纤部分具有第一折射率，而试剂层具有第二折射率。当任何物质键合到试剂层时，形成包括所述试剂层和所述物质的所得层。所得层可以被处理为具有均匀的折射率。
[0016]所述方法允许使用光纤探针来测定样品溶液中的物质的浓度。所述方法包括以下步骤：(i)将光纤探针的远端浸入样品溶液中，(ii)使光源与光纤探针的近端光学耦合，(iii)检测从光纤部分的远端表面与试剂层之间的界面反射的至少第一光束，以及从试剂层与样品溶液之间的界面反射的、从光纤探针的远端反射的第二光束，(iv)在第一时间检测由第一光束和第二光束形成的干涉图案，(v)在第二时间检测由第一光束和第二光束形成的干涉图案，以及(vi)基于干涉图案中是否发生偏移来确定所述物质是否存在于样品溶液中。所述物质的浓度可基于干涉图案的偏移并且基于第一时间与第二时间之间的差来确定。
[0017]用于检测样品溶液中的物质浓度的系统具有用于提供光束的光源、光纤探针、检测器、光纤耦合器、光纤连接器以及处理器。光纤耦合器包括：具有用于接收入射光束的近端的第一光纤部分、具有用于将反射的干涉光束递送到检测器的近端的第二光纤部分，以及具有用于连接到光纤探针的远端的第三光纤部分。光纤探针包括用于连接到光纤耦合器的近端和具有设置在其上的试剂层的远端尖端。光纤探针产生来自入射光束的至少第一反射光束和第二反射光束。检测器检测由第一反射光束和第二反射光束形成的干涉图案。耦合器使光源与光纤探针光学耦合并且使光纤探针与检测器光学耦合。处理器测定与在第一时间由检测器检测到的干涉图案相关联的相位、测定与在第二时间由检测器检测到的干涉图案相关联的相位，并且基于与在第一时间和第二时间由检测器检测到的干涉图案相关联的相位的偏移确定物质的浓度。
[0018]我们已了解到，BLI技术可用于测定LAG
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3蛋白或其片段、衍生物或类似物的制剂的MHC II类结合活性，并且所述方法尤其可用作所述化合物的GMP级生产中的质量控制测定。
[0019]在特定实施方案中，本专利技术的方法包括测定LAG
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3蛋白、片段、衍生物或类似物与MHC II类表达细胞上存在的MHC II类分子的结合。在所述实施方案中，可将LAG
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3蛋白、片段、衍生物或类似物固定到BLI探针的试剂层，并且MHC II类表达细胞是在溶液中的。
[0020]根据本专利技术，可以使用US 5,804,453中描述的探针、方法和系统来测定LAG
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于测定包含淋巴细胞活化基因
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3(LAG
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3)蛋白的衍生物的制剂的生物活性的方法，其中LAG
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3蛋白的衍生物包含与LAG
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3蛋白的结构域D1或与结构域D1和D2具有至少70％氨基酸同一性的氨基酸序列，其中所述方法包括使用生物层干涉术(BLI)测定所述LAG
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3蛋白的衍生物与溶液中的MHC II类表达细胞上存在的MHC II类分子的结合，并且其中LAG
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3蛋白的衍生物固定化到BLI探针的试剂层。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MHC II类表达细胞以至少1E6/mL的密度存在。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MHC II类表达细胞以至少4E6/mL的密度存在。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述MHC II类表达细胞以至少8E6/mL的密度存在。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述试剂层已用封闭试剂预处理以最小化所述MHC II类表达细胞与所述试剂层的非特异性结合。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述封闭试剂包括白蛋白。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述封闭试剂包括牛血清白蛋白。8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述MHCII类表达细胞是Raji细胞。9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述MHCII类表达细胞是从冷冻储备溶液获得的解冻的、即用型细胞。10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括针对多种不同浓度的LAG
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3蛋白的衍生物，测定所述LAG
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3蛋白的衍生物与所述MHC II类分子的结合速率，以及产生针对所述结合速率的剂量
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应答曲线。11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在与用于测定所述制剂的所述LAG
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3蛋白的衍生物的结合相同的条件下，通过使用生物层干涉术(BLI)测定参比样品的所述LAG
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3蛋白的衍生物与MHC II类分子的结合来测定LAG
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3蛋白的衍生物的所述参比样品的MHC II类结合活性，并且将针对所述参比样品测定的所述MHCII类结合活性与针对所述制剂测定的所述MHC II类结合活性进行比较。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述参比样品的所述MHC II类结合活性被设定为100％...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，贾晓青，
申请(专利权)人：伊缪泰普有限公司，
类型：发明
国别省市：