【技术实现步骤摘要】
一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法
本专利技术涉及一种方法，尤其涉及一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法。
技术介绍
水杨酸及其衍生物在医药、化工等领域应用广泛，但由于其有毒且自然降解时间长，会影响自然生态平衡和人类健康，因此，研究其降解方法对于实现绿色生产具有重要意义和必要性。而且，水杨酸及其衍生物的脱羧产物—苯酚及其衍生物，也是重要的有机化工原料，在化学工业、医药工业有着广泛的应用，既可作为化学合成的中间体，也是重要的化学药品原料。利用芳香酸脱羧酶催化水杨酸衍生物的脱羧反应，具有反应条件温和、专一性高等酶反应的共同特性，可以大大降低反应的能垒，使反应更容易进行。水杨酸脱羧酶(Salicylicaciddecarboxylase，Sdc)也是其中之一，该酶是2010年由Kirimura研究小组在丝孢酵母TrichosporonmoniliiformeWU-0401中发现的一种可逆酶。除了能够催化以苯酚为底物的Kolbe-Schmitt反应生成水杨酸及其逆反应以外，水杨酸脱羧酶还可以催化2,4-二羟基苯甲酸和γ-二羟基苯甲酸脱羧生成间苯二酚，催化2,3-二羟...
【技术保护点】
1.一种酶法降解2,6‑二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到宿主菌中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于Amp浓度为90～110μg·mL‑1的LB液体培养基中，摇床培养为一号种子液；将一号种子液按0.8～1.5％的比例接种于新的Amp浓度为90～110μg·mL‑1的LB液体培养基中，摇床培养为二号种子液，并使其OD600到达0.4～0.8，然后加入IPTG使其成为最终浓度为0.08～0.2mM的培养液，培养液经诱导、离心后，收集菌体备用；步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬，在冰浴...
【技术特征摘要】
1.一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到宿主菌中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为一号种子液；将一号种子液按0.8～1.5％的比例接种于新的Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为二号种子液，并使其OD600到达0.4～0.8，然后加入IPTG使其成为最终浓度为0.08～0.2mM的培养液，培养液经诱导、离心后，收集菌体备用；步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬，在冰浴中进行超声破碎，将破碎后的细胞破碎液进行离心分离，上清液即为粗酶液；将粗酶液用10～14％的SDS-PAGE检测蛋白表达情况，采用His-Trap亲和层析柱对Sdc进行纯化；步骤三：Sdc浓度测定：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化酶Sdc的浓度；步骤四：Sdc活力测定：在浓度为10～60mM的2,6-二羟基苯甲酸溶液中加入含0.1mg/mLSdc的缓冲溶液，总反应体积为1～2mL，温度25～60℃，加入强酸性溶液终止反应，反应液经9500～10500r/min离心后，经0.22μm滤膜过滤后，用HPLC测定产物浓度。2.根据权利要求1所述的酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述His-Trap亲和层析柱对Sdc纯化的步骤为：I、启动系统：首先打开蛋白纯化系统电源，待系统稳定后，启动工作站，打开A泵和B泵，用MilliQ水以5mL·min-1的速度冲洗系统管路至基线水平；II、接柱子：将镍柱His-TrapFFcrude与纯化系统的管路连接，注意不要带入气泡，然后用大于等于5个柱体积的MilliQ水以1mL·min-1的速度对柱子进行冲洗；III、柱平衡：将A泵头放入结合缓冲液中，B泵头放入洗脱缓冲液中，先用大于等于5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1速度冲洗柱子，然后再用大于等于5个柱体积的结合缓冲液在同样的流速下对镍柱进行平衡；IV、上样：用A泵将5mL粗酶液上到柱上；V、平衡：用15个柱体积的结合缓冲液以0.5mL·min-1的速度冲洗，直到吸收曲线稳定，此时目的蛋白结合在镍柱上，...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡彦营，张爱民，李薇，韩小龙，杨永涛，
申请(专利权)人：济宁学院，
类型：发明
国别省市：山东,37
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