条件活性多肽及产生它们的方法技术

一种从亲本多肽制备条件活性多肽的方法，其包括以下步骤：通过使用选自增加DNA中带电荷的氨基酸残基的密码子的总数和减少DNA中不带电荷的氨基酸残基的密码子的总数中的一种或多种技术来增加亲本多肽的净电荷以演变编码亲本多肽的DNA从而产生突变DNA的步骤；表达突变DNA以获得突变多肽；从在一种条件的第一值下的第一测试中与在同种条件的第二值下的第二测试中的同种活性相比表现出活性降低的突变多肽中选择条件活性多肽。还提供了条件活性多肽、包括所述条件活性多肽的药物组合物、纳米颗粒和其药物缀合物及其用途。

Conditionally Active Peptides and Their Production

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】条件活性多肽及产生它们的方法
本专利技术涉及提供具有期望活性的改良多肽的领域。具体而言，本专利技术涉及条件活性多肽和从亲本多肽产生条件活性多肽的方法，其中所述条件活性多肽在一种条件下比在另一种条件下更具活性。
技术介绍
有大量文献描述了演变蛋白(特别是酶或抗体)的各种特性以使蛋白在不同条件下具有活性或稳定性的方法。例如，酶已经被演变为在较高温度下是稳定的。在酶活性在较高温度下增强的情况下，该活性增强大部分可归因于Q10法则中通常描述的更高的动力活性，在Q10法则中，估计温度每增加10℃，酶的转换率增加一倍。此外，还存在使蛋白在其正常工作条件下变得不稳定的自然突变，从而降低正常工作条件下的蛋白活性。例如，存在在较低温度下具有活性的已知温度突变体，但与衍生出该突变体的野生型蛋白相比其活性通常处于降低的水平。期望生成具有条件活性的多肽，例如在一种条件下活性较低或几乎无活性，但在另一种条件下具有活性。还期望产生在特定环境中被激活或失活的多肽，或随着时间推移被激活或失活的多肽。除了温度以外，能够演变或改进多肽以获得条件活性的其它条件包括pH、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度。除了多肽的活性之外，通常期望在演变过程中改进其它特性，包括耐化学性和蛋白水解抗性。许多已知的突变多肽具有改进的性质，其中已经进行了一个或多个氨基酸替换以实现改进的性质。例如，美国专利第8,318,469号公开了具有两种突变(G43D和F665Y)之一的突变布氏栖热菌(Thermusbrockianus)核酸聚合酶。与没有突变的聚合酶相比，突变聚合酶具有降低的5'-3'核酸外切酶活性。DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性通常是不期望的，因为这种活性会消化核酸，包括具有未保护的5'末端的引物。美国专利第8,536,301号公开了以高亲和力结合纤连蛋白α5β1或玻连蛋白αvβ3和αvβ5整联蛋白的细胞表面受体的突变多肽。突变肽基于分子支架，该分子支架中插入了含有RGD整联蛋白结合基序的亚序列。该亚序列具有约9-13个氨基酸的长度，RGD侧翼为多种氨基酸。分子支架优选基于打结素(knottin)，例如EETI、AgRP和漏斗网蛛毒素(Agatoxin)IVB，这些肽具有严格限定的三维构象。美国专利第8,921,086号公开了突变DNA聚合酶，其对核苷酸类似物进入活性位点区具有改善的耐受性。相对于野生型DNA聚合酶，突变聚合酶可以在375位和512位具有氨基酸替换。375位处的替换包括E375H、E375S、E375K、E375R、E375A、E375Q、E375W、E375Y和E375F。512位处的替换包括K512W、K512Y、K512F、K512L、K512H、K512D和K512E。美国专利第6,329,178号公开了由天然存在的DNA聚合酶通过突变其活性位点中的一个或多个氨基酸而衍生的突变DNA聚合酶。与天然存在的DNA聚合酶相比，突变DNA聚合酶具有改变的保真度或改变的酶活性。天然存在的DNA聚合酶具有包含氨基酸序列基序(AspTyrSerGlnIleGluLeuArg或LeuLeuVa1AlaLeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArg)的活性位点。突变DNA聚合酶具有(a)氨基酸序列基序中的两个或更多个氨基酸替换，或(b)氨基酸序列基序中除Glu之外的氨基酸替换。与衍生它们的野生型蛋白相比，这些突变蛋白具有改变的性质。然而，这些突变蛋白的改变的性质不随条件的变化而变化。将亲本多肽演变为在一种条件下为失活或几乎失活(小于50％、30％或10％活性，特别是1％活性)，同时在另一种条件下保持等同的活性或更好的活性可能需要一种或多种去稳定突变(destabilizingmutation)与一种或多种活性增强突变共存。需要开发条件活性多肽。美国专利第8,709,755号公开了一种用于产生条件活性抗体的方法，其包括以下步骤：演变编码野生型抗体的DNA以产生突变体抗体，对突变体抗体和野生型抗体进行第一条件下的测试和第二条件下的测试，并从至少一种突变抗体中选择条件活性抗体，所述突变抗体表现出以下两种特性：(a)在第一条件下的测试中与抗原的结合活性与在第一条件下的相同测试中的野生型抗体的结合活性相比降低，和(b)在第二条件下的测试中与抗原的结合活性与在第二条件下的相同测试中的野生型抗体的活性相比增强。当用作治疗性抗体时，该条件活性抗体优选在正常生理条件下具有降低的活性，并且在可能存在于诸如肿瘤微环境的治疗部位的异常条件下具有增强的活性。作为这种优先作用的结果，该条件活性抗体可能潜在地对存在正常生理条件的正常组织/器官造成较小的伤害，因此产生较少的副作用。这可以允许进行更长时间的治疗和/或使用更高剂量的条件活性抗体。本专利技术提供了用于产生条件活性多肽的新方法，其利用定向诱变来更有效地产生。本专利技术还提供了通过该方法产生的新的条件活性多肽。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了通过增加亲本多肽的净电荷可获得的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽在一种条件的第一值下的第一测试中与在同种条件的第二值下的第二测试中的同种活性相比表现出活性降低。带电荷的氨基酸残基可选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和任选的组氨酸。在每个前述实施方案中，可以通过选自增加多肽中带电荷的氨基酸残基的总数，减少多肽中不带电荷的氨基酸残基的总数或它们的组合中的一种或多种技术来增加净电荷。在每个前述实施方案中，所述条件可选自pH、温度、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激、电解质浓度、蛋白浓度及它们中的两种或更多种的组合。在每个前述实施方案中，所述条件可以是pH，并且该条件活性多肽可以在正常生理pH下表现出活性降低，而在与正常生理pH不同的异常pH下表现出活性增强。在每个前述实施方案中，可以在具有小于900a.m.u的分子量且pKa与活性增强的pH相差至多2个单位或者3个单位的至少一种物质的存在下测试条件活性。在前述实施方案中，所述物质的pKa可以在pH的第一值和pH的第二值之间。在每个前述实施方案中，可以在选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、硫化氢、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、铵、碳酸氢盐、磷酸二氢盐及它们的组合的至少一种物质的存在下测试条件活性。在每个前述实施方案中，第一测试和第二测试可以在不存在血清的测试溶液中进行。在每个前述实施方案中，可通过氨基酸残基替换、氨基酸插入或它们的组合将一个或多个带电荷的氨基酸残基引入亲本多肽中来增加净电荷。在每个前述实施方案中，可以将一个或多个带电荷的氨基酸残基引入亲本多肽的活性位点。在每个前述实施方案中，可以将一个或多个带电荷的氨基酸残基引入亲本多肽的活性位点外的区域。在每个前述实施方案中，条件活性多肽可以是条件活性抗体(Ab)，并且可以将一个或多个带电荷的氨基酸残基引入条件活性抗体的至少一个互补决定区。在每个前述实施方案中，所述一个或多个带电荷的氨基酸残基可以是少于五个的带电荷的氨基酸残基，或少于四个的带电荷的氨基酸残基，或少于三个的带电荷的氨基酸残基，或少于两个的带电荷的氨基酸残基。在每个前述实施方案中，所述一个或多个带电荷的氨基酸残基可选自天冬氨酸和谷氨酸。在每个前述实施方案中，所述条件活性多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种条件活性多肽，其可通过增加亲本多肽的净电荷获得，其中所述条件活性多肽在一种条件的第一值下的第一测试中与在同种条件的第二值下的第二测试中的同种活性相比表现出活性降低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.31 US 62/382,0231.一种条件活性多肽，其可通过增加亲本多肽的净电荷获得，其中所述条件活性多肽在一种条件的第一值下的第一测试中与在同种条件的第二值下的第二测试中的同种活性相比表现出活性降低。2.根据权利要求1所述的条件活性多肽，其中所述条件是pH。3.根据权利要求1所述的条件活性多肽，其中第一测试和第二测试在不存在血清的测试溶液中进行。4.根据权利要求1所述的条件活性多肽，其中通过氨基酸残基替换、氨基酸插入或它们的组合将一个或多个带电荷的氨基酸残基引入亲本多肽中来增加净电荷。5.根据权利要求2所述的条件活性多肽，其中所述带电荷的氨基酸残基选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸。6.根据权利要求5所述的条件活性多肽，其中所述带电荷的氨基酸残基选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸。7.根据权利要求5所述的条件活性多肽，其中将一个或多个带电荷的氨基酸残基引入亲本多肽的活性位点。8.根据权利要求5所述的条件活性多肽，其中将一个或多个带电荷的氨基酸残基引入亲本多肽的活性位点外的区域。9.根据权利要求8所述的条件活性多肽，其中所述活性位点外的区域是抗体的恒定区或抗体的骨架区。10.根据权利要求4-9中任一项所述的条件活性多肽，其中所述一个或多个带电荷的氨基酸残基是少于五个的带电荷的氨基酸残基，或少于四个的带电荷的氨基酸残基，或少于三个的带电荷的氨基酸残基，或少于两个的带电荷的氨基酸残基。11.根据权利要求4-10中任一项所述的条件活性多肽，其中所述一个或多个带电荷的氨基酸残基选自天冬氨酸和谷氨酸。12.根据权利要求4-11中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽是条件活性抗体，并且所述一个或多个带电荷的氨基酸残基被引入所述条件活性抗体的至少一个互补决定区中。13.根据权利要求1-12中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽在所述条件的第一值下可逆地失活。14.根据权利要求1-13中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件选自pH、温度、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激、电解质浓度。15.根据权利要求1-14中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件是pH。16.根据权利要求15所述的条件活性多肽，其中所述第一测试和第二测试在具有小于900a.m.u的分子量且pKa与pH的第二值相差至多3个单位的至少一种物质的存在下进行。17.根据权利要求15所述的条件活性多肽，其中所述第一测试和第二测试在相同温度下，在具有小于900a.m.u的分子量且pKa在pH的第一值和pH的第二值之间的至少一种物质的存在下进行。18.根据权利要求12所述的条件活性多肽，其中所述第一测试和第二测试在选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、硫化氢、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、碳酸氢盐、二硫化物、铵、磷酸二氢盐及它们的任意组合中的物质的存在下进行。19.根据权利要求1-18中任一项所述的条件活性多肽，其中在所述条件的第二值下的测试中的增强的活性与在所述条件的第一值下的测试中的降低的活性的比值为至少1.3，或至少1.5，或至少1.7，或至少2.0，或至少3.0，或至少4.0，或至少6.0，或至少8.0，或至少10.0，或至少20.0，或至少40.0，或至少60.0，或至少100.0。20.根据权利要求1-19中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件的第一值是在将所述条件活性多肽施用给个体的位点处的生理条件的正常范围内或个体中所述条件活性多肽的作用位点处的组织或器官处的生理条件的正常范围内的正常生理条件的值，所述条件的第二值是异常条件的值，其偏离在所述条件活性多肽施用位点处的生理条件的正常范围或偏离在所述条件活性多肽的作用位点处的组织或器官处的生理条件的正常范围。21.根据权利要求1-20中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽是蛋白或蛋白片段。22.根据权利要求1-21中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽选自抗体、单链抗体和抗体片段，并且所述活性是与抗原的结合活性。23.根据权利要求1-22中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽是抗体的Fc区。24.根据权利要求1-21中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽是酶，并且所述活性是酶活性。25.根据权利要求1-21中任一项所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽选自受体、调节蛋白、可溶性蛋白、细胞因子，以及受体、调节蛋白、应激蛋白、穹窿体相关蛋白、神经元蛋白、消化道蛋白、生长因子、线粒体蛋白、胞质蛋白、动物蛋白、结构蛋白和植物蛋白的片段。26.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-25中任一项所述的条件活性多肽和药学上可接受的载体。27.权利要求1-25中任一项所述的条件活性多肽用于治疗实体瘤、发炎关节或者脑部疾病或病症的用途。28.权利要求1-25中任一项所述的条件活性多肽用于从个体中去除衰老细胞的用途。29.一种治疗实体瘤、发炎关节或者脑部疾病或病症的方法，其包括施用权利要求1-25中任一项所述的条件活性多肽的步骤。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述条件活性多肽作为包含所述条件活性多肽的嵌合抗原受体的一部分施用，并且将所述嵌合抗原受体引入T细胞或NK细胞中。31.根据权利要求30所述的方法，其中T细胞或NK细胞用作过继性细胞疗法的一部分。32.根据权利要求29所述的方法，其中所述条件活性多肽与纳米颗粒连接。33.根据权利要求29所述的方法，其中所述条件活性多肽以包含所述条件活性多肽的抗体-药物缀合物的形式施用。34.一种核酸分子，其编码权利要求1-25中任一项所述的条件活性多肽。35.一种包含权利要求34所述的核酸分子的表达载体。36.一种包含权利要求35所述的表达载体的宿主细胞。37.根据权利要求26所述的药物组合物，其还包含至少一种其他的抗癌剂。38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述至少一种其他的抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂、激素治疗剂、毒素或免疫治疗剂。39.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述至少一种其他的抗癌剂是选自紫杉烷、美登木素生物碱、澳瑞他汀、卡里奇霉素、倍癌霉素、一甲基澳瑞他汀E、安眠药、金霉素、蒽环霉素、CC-1065类似物、多西紫杉醇、组织蛋白酶、蓖麻毒蛋白、白树毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、白喉毒素、核糖核酸酶和有毒放射性同位素的毒素。40.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述条件活性多肽与至少一种其他的抗癌剂、或至少四种其他的抗癌剂、或至少六种其他的抗癌剂缀合。41.一种诊断个体中存在癌症的方法，其包括以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰·M·肖特，怀文·张，格哈德·弗雷，
申请(专利权)人：生物蛋白有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US