抗人D-Dimer抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及抗人D‑Dimer抗体及其在制备胶体金定量检测卡中的应用。申请人制备了多种抗人D‑Dimer抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人临床样本检测的人D‑二聚体的胶体金定量检测卡。

Anti-human D-Dimer antibody and its application

【技术实现步骤摘要】
抗人D-Dimer抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体的涉及两种抗人D-二聚体(D-Dimer)抗体及其制备方法以及上述抗体在人D-二聚体检测中的应用。
技术介绍
D-二聚体(D-Dimer)是纤维蛋白降解的最终产物(分子量约180kDa)，其含有三个多肽链的降解产物，通过二硫键交联。二聚体结构通过γ链C端之间的两个异肽键形成交联结构而维持。正常状态下，纤溶酶和抑制酶之间保持了动态平衡，使血液循环能正常进行。人体内的纤溶系统，对保持血管壁的正常通透性及维持血液的流动状态和组织修复发挥着重要的作用。病理状态下，机体发生凝集时，凝血酶作用于纤维蛋白，转变为交联纤维蛋白，同时纤溶系统被激活，降解纤维蛋白形成各种碎片。γ链可将两个含D片段的碎片连接起来，形成D-二聚体。D-二聚体的升高，反映继发性纤溶亢进。临床上，D-二聚体的检测主要用于深静脉血栓、肺栓塞的早期排除诊断；弥漫性血管内凝血的早期诊断和动态监测；外科手术后的血栓监测；妊娠高血压、先兆子娴的监测；恶性肿瘤、白血病的早期识别及血栓监测；肝脏疾病、肾脏疾病的监测；溶栓治疗评估及血栓复发的监测；心血管疾病病情评估；脑梗死鉴别和治疗监测等等。目前国内外D-二聚体胶体金定量产品的应用主要是在即时检验(POCT)领域，国外广泛应用与门诊、急诊、ICU病房及医生诊所，作为疾病就诊早期的快速诊断手段，有别于临床检验中心及各种大型医院检验科所采用的全自动生化分析仪或化学发光仪等，具有简便、快速同时兼顾准确性的特点。D-二聚体胶体金定量产品在欧美已有广泛应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人D-二聚体的抗体。更具体地说：本专利技术的第一目的在于提供两种抗人D-二聚体抗体。第一种抗人D-二聚体抗体(DD17)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3。优选的是上述抗体(DD17)的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。第二种抗人D-二聚体抗体(DD89)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：9所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：11所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：12所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：14所示的LCDR3。优选的上述抗体(DD89)的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示。本专利技术第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体(DD17)的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；所述单链抗体(DD89)的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示。本专利技术第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体(DD17)的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示，和编码单链抗体(DD89)的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。本专利技术第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本专利技术第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞可以是大肠杆菌、毕赤酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。本专利技术第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主细胞表达抗体；2)然后从宿主细胞中纯化、收集抗体。本专利技术的第七个目的在于提供上述抗人D-二聚体抗体在检测人D-二聚体含量中的应用。本专利技术的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人D-二聚体的抗体对组合DD17和DD89；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。本专利技术的第九个目的在于提供一种利用所述抗人二聚体抗体检测人二聚体的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体DD89，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体DD17。所述分封闭液是1％-10％BSA、0.01MPB溶液，pH7.4。所述金标抗体复溶液是1％-10％BSA、5％海藻糖、0.025％tween20、0.01MPB溶液，pH7.4。所述抗体包被液是0-0.25％BSA、0-2.5％异丙醇、0.01MPB溶液，pH7.4。所述样本稀释液是0-2.5％BSA、0-2.5％tween20、0.01％-0.1％Proclin300、0.01MPBS溶液，pH7.4。所述质控带位置包被抗His标签抗体或ProteinL。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗His标签抗体优选鼠抗His抗体。本专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(DD17及DD89)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可满足人临床样本检测的胶体金定量检测试纸卡。附图说明图1.抗体DD17及DD89特异性检测效果图(WesternBlot)，泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为人天然D-二聚体。图1(a)检测抗体为DD17-HRP；图1(b)检测抗体为DD89-HRP。图2.本专利技术胶体金免疫层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为PVC片材。图3.D-二聚体胶体金检测卡检测范围拟合曲线。图4.D-二聚体胶体金检测卡线性范围拟合曲线。图5.D-二聚体胶体金检测卡与对照产品比对拟合曲线。具体实施方式定义“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将VL的N端连接至VH的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。互补决定区(complementarity-determiningregion，CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。实施例1.抗人D-二聚体杂交瘤细胞株的制备1.动物免疫以天然人D-二聚体(购买于Meridian公司)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗人D‑Dimer抗体，包括：重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；以及轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

【技术特征摘要】
1.抗人D-Dimer抗体，包括：重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：9所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：11所示的HCDR3；以及轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：12所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：14所示的LCDR3。2.权利要求1所述的抗人D-Dimer抗体，其特征是重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，轻链可变...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵利利，王安良，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32