本发明专利技术的目的是提供抗Tau抗体及其在治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤中的应用，所述抗体能够特异性结合tau蛋白，尤其是能够特异性结合过度磷酸化的tau蛋白；通过给予所述抗体，其能够延缓阿尔茨海默病小鼠模型中异常磷酸化tau蛋白的表达，能够起到预防或治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤等tau蛋白相关的神经退行性疾病的效果。
Anti-Tau Antibody and Its Application in the Treatment of Alzheimer's Disease and Traumatic Brain Injury
【技术实现步骤摘要】
抗Tau抗体及其在治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤中的应用
本专利技术属于抗体领域，特别涉及抗Tau抗体及其在治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤中的应用。
技术介绍
Tau蛋白是一种微管相关蛋白，其可被分为四个区域，即N末端突出区、富含脯氨酸区、微管结合区、和C末端，Tau蛋白正常情况下与微管结合，但在被糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)催化发生磷酸化后可以从微管脱落，引起微管稳定性下降或解聚；Tau蛋白磷酸化和去磷酸化之间的平衡是维持神经元微管稳定性、保证细胞完成线粒体等细胞器在轴浆中正常运输的前提。创伤性脑损伤(traumaticbraininjury，TBI)是由于意外性或非意外性损伤所引起的持续性脑损伤。临床表现包括意识丧失、癫痫发作、特殊姿势、晕厥、偏瘫等。在创伤性脑损伤的研究中发现tau蛋白过度磷酸化可以引起微管解聚、线粒体分布异常和线粒体功能障碍，最终导致了神经元蜕变或凋亡；顺式磷酸化tau蛋白是脑损伤后神经退行性病变的一个早期驱动因子，其可促进tau蛋白病理化。阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)多在老年时期起病，起病隐秘，病程缓慢时间长且不可逆，是一组目前病因并不明确的脑部原发性退行性变性疾病，其基本病理特点表现为Aβ沉积形成的老年斑、磷酸化Tau蛋白沉积形成的神经纤维缠结以及大量胆碱能神经元的丢失等。目前有研究表明可通过抗tau蛋白抗体来治疗或辅助治疗阿尔茨海默病，能够起到缓解疾病进展的作用。基于上述认知，利用特定的抗tau蛋白抗体治疗tau蛋白异常相关的疾病被认为是一个可行的措施。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗tau蛋白抗体，所述抗体能够特异性结合磷酸化tau蛋白，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，重链氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，本专利技术提供一种编码核苷酸，其能编码抗tau蛋白抗体。更进一步地，本专利技术还提供一种重组表达载体，所述载体包含上述编码核苷酸。更进一步地，本专利技术还提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞能够分泌抗tau蛋白抗体。本专利技术还提供抗tau蛋白抗体在制备治疗过度磷酸化tau蛋白相关的神经退行性疾病的药物中的用途。进一步地，所述抗tau蛋白抗体的轻链氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，重链氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。更进一步地，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、创伤性脑损伤。更进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。所述载体优选为赋形剂、稳定剂。有益效果本专利技术的抗tau蛋白抗体能够特异性结合磷酸化的tau蛋白，能够显著改善阿尔比海默病等过度磷酸化tau蛋白相关的神经退行性疾病的症状。本专利技术为阿尔比海默病、创伤性脑损伤等过度磷酸化tau蛋白相关的神经退行性疾病的预防和或治疗提供了一种新的有效途径。附图说明图1：PHF-tau蛋白免疫后小鼠血清滴度。图2：抗tau抗体特异性westernblot检测结果，其中PHF-tau为磷酸化tau蛋白，tau为非磷酸化tau蛋白。图3：抗体E2与PHF-tau蛋白的亲和力。图4：单克隆抗体E2对阿尔茨海默病小鼠的治疗效果。具体实施方式在下文中更详细地描述了本专利技术以有助于对本专利技术的理解。应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本专利技术上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由专利技术人为了对本专利技术的最佳说明而限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：抗tau蛋白抗体杂交瘤制备为了获得能够特异性结合创伤性脑损伤、阿尔茨海默病等神经系统疾病中发生病变的tau蛋白的抗tau蛋白抗体，选择与疾病状态密切相关的PHF-tau作为抗原制备抗tau蛋白抗体。所述PHF-tau蛋白通过已知的方法制备纯化，即选取阿尔茨海默病患者死后的皮质组织，使用组织匀浆器以1000rpm将5mg额皮质在8-10倍体积的冷缓冲液H(10nMTris、800mMNaCl、ImMEGTA和10％蔗糖，pH7.4)中匀浆化，匀浆化的材料在高速离心机中以27000g离心20分钟。弃去团块并将上清液调整至1％(W/V)N-月桂酰肌氨酸和1％(V/V)2-巯基乙醇的最终浓度，并在37℃下温育2小时。随后将上清液以108000g在超高速离心机中在20℃下离心35分钟，将团块在PBS中小心洗涤并悬浮于PBS中，上清液如所述的离心第二次，并且将最终团块溶解而获得纯化的PHF-tau蛋白，等分且在-80℃下冷冻。小鼠免疫取6-8周雌性BALB/c小鼠6只，苦味酸染色标记，断尾取血制备基础血清。首次免疫：将PHF-tau蛋白溶液(0.4mg/ml)与等体积弗氏完全佐剂混合，反复吹打混匀至完全乳化，按每只小鼠200μl的剂量，腹腔注射。加强免疫：初期免疫后每隔2周，将PHF-tau蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂混合，反复吹打混匀至完全乳化，按每只小鼠100μl的剂量，腹腔注射。冲击免疫：累计免疫8次后，用脾内注射的方式，用PHF-tau蛋白进行加强免疫，剂量为25μg/只。方法是：先将小鼠用乙醚麻醉，置于台面右侧卧，暴露左肋部即部分脊背部，用酒精消毒后，无菌操作剪开腹部皮肤暴露腹膜，透过腹膜找到脾脏，用1ml注射器将PHF-tau蛋白溶液隔着腹膜延长轴进针缓缓注射入脾脏，注射完毕后封闭切口，三天后取脾脏细胞进行细胞融合。杂交瘤细胞制备：将骨髓瘤细胞(SP2/0)传代扩大培养，融合时，用滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于离心管中，1000rpm离心5-10min，弃去上清，加入30ml1640培养基，同法离心洗涤一次，然后将细胞重悬浮于10ml1640培养基，混匀，取骨髓瘤细胞悬液，细胞计数后备用。取免疫完的BALB/c小鼠，摘除眼球放血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，通过常规操作取小鼠脾脏并剥去周围结缔组织，将脾脏置于盛有不完全培养基的平皿中，在尼龙网上轻轻挤压脾脏获得脾细胞单细胞悬液。收获脾细胞悬液，1000rpm离心5-10min，用不完全1640培养基离心洗涤2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液作活细胞计数后备用。在细胞融合前1天制备并培养饲养细胞。将1×108脾细胞与2×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支离心管中，补加1640培养基至30ml，充分混匀，1000rpm离心5-10min，将上清尽量吸净，轻击融合管底部使沉淀细胞松散均匀，置水浴中预热，用1ml吸管在1min内滴加预热至37℃的PEG1ml，边加边轻轻晃动，静置1-2min，用1Oml吸管在2-3min内缓慢滴加20-30ml预热至37℃的不完全1640培养基至终止反应。1000rpm离心5min，弃去上清，加入40ml2×HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，接种于前一天已经加入饲养细胞的96孔培养板中培养，每孔0.1ml，然后将培养板置于37℃，5％CO2培养箱内培养，5天后用2×HAT培养基换出1/2培养基，以后每3天用2×HAT培养基换出1/2培养基，14天本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗tau蛋白抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述抗体能够特异性结合磷酸化tau蛋白，并且所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗tau蛋白抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述抗体能够特异性结合磷酸化tau蛋白，并且所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，重链氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.一种编码核苷酸，其特征在于：所述编码核苷酸编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分。3.一种重组表达载体，其特征在于：所述载体包含权利要求2所述的编码核苷酸。4.一种杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞包含权利要求3所述的重组表达载体。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：肖健，张宏宇，吴艳青，吴疆，许可，何华成，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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