一种NOTCH3基因突变的检测方法及其引物组技术

本发明专利技术涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种用于检测NOTCH3基因突变的方法及其引物组。本发明专利技术对NOTCH3基因突变区域的核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增，最后以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明专利技术的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快等优点。为显性遗传性脑血管病伴皮质下梗死和白质脑病（CADASIL）的遗传学方面的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为该类疾病的临床诊断提供理论基础。

A Detection Method for NOTCH3 Gene Mutation and Its Primer Group

【技术实现步骤摘要】
一种NOTCH3基因突变的检测方法及其引物组
本专利技术涉及分子生物学基因
和医学领域，涉及用分子生物学方法对NOTCH3基因突变位点检测的引物组，特别涉及用IonTorrent半导体芯片测序技术对NOTCH3基因突变位点进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。
技术介绍
显性遗传性脑血管病伴皮质下梗死和白质脑病（cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleuk-oencephalopathy，CADASIL）是伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病，是一种遗传性小动脉疾病。CADASIL的病因是由位于19号染色体上的NOTCH3基因突变所致，表现为皮质下缺血事件，并导致进行性痴呆伴假性球麻痹。其主要为成年发病的一种遗传性脑血管病，发病平均年龄45岁，临床表现为反复发作的卒中和后期进行性痴呆。目前的研究认为，CADASIL由NOTCH3基因突变引起。该基因定位于染色体19p13，由33个外显子组成，其编码的NOTCH3受体有2321个氨基酸残基。70%～80%的NOTCH3基因突变发生在外显子3和4，以外显子4突变最多见。该基因的突变可引起一系列的生化、病理生理学和血流动力学改变。NOTCH3编码的蛋白包含有34个EGFr结构域，这些是模块化的蛋白组件,含大约40个氨基酸，每个包含有6个固定数目的半胱氨酸残基；经过两两配对，这些半胱氨酸形成3个双硫键，对于EGFr结构域的二级结构是非常重要。CADASIL患者NOTCH3基因的突变导致非平衡状态的半胱氨酸数目（通常是5或7），形成突变的EGFr结构域，其中一个半胱氨酸处于非配对状态，无法形成正常的二硫键，导致EGFr结构域的错误折叠，导致NOTCH3的多聚体化。故大多数的突变是此类突变。目前NOTCH3基因至少存在179个错义突变或无义突变位点以及6个缺失突变位点，涉及127个密码子。目前检测CADASIL相关NOTCH3基因突变的方法主要为经典测序等，存在通量低、成本贵等问题。IonTorrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H+，H+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。IonTorrent半导体芯片测序技术与传统Sanger法及二代测序技术比较，IonTorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对H+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1G通量的测序检测仅需2~3小时，是传统Sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。目前尚没有报道IonTorrent半导体芯片测序技术专门用于NOTCH3基因突变的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对NOTCH3基因突变的定性、定量检测的方法及其引物。为解决上述问题，本专利技术采取以下技术方案：利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的CADASIL相关NOTCH3基因突变位点，用PrimerExpressSoftware5.0软件设计PCR引物。用于检测NOTCH3基因序列片段1的引物，是由序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattacctgggctcctggctgat-3’SEQIDNo:1；下游引物：5’-ggaccactggtggctctga-3’SEQIDNo:2。用于检测NOTCH3基因序列片段2的引物，是由序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattagcccaaccaagccatctc-3’SEQIDNo:3；下游引物：5’-gccagccaccactgaactct-3’SEQIDNo:4。用于检测NOTCH3基因序列片段3的引物，是由序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattatggaaccgcccgattct-3’SEQIDNo:5；下游引物：5’-ccaggacagggtgagtttagga-3’SEQIDNo:6。用于检测NOTCH3基因序列片段4的引物，是由序列表中SEQIDNO:7和SEQIDNO:8组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattacagtcctaaactcaccctgtcc-3’SEQIDNo:7；下游引物：5’-catccacgtcgcttcgg-3’SEQIDNo:8。用于检测NOTCH3基因序列片段5的引物，是由序列表中SEQIDNO:9和SEQIDNO:10组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattagatgagtgtcgggtgggtg-3’SEQIDNo:9；下游引物：5’-ccgtggggttctcacatagt-3’SEQIDNo:10。用于检测NOTCH3基因序列片段6的引物，是由序列表中SEQIDNO:11和SEQIDNO:12组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattacaggaccactatgtgagaaccc-3’SEQIDNo:11；下游引物：5’-cccacccctctgactctcc-3’SEQIDNo:12。用于检测NOTCH3基因序列片段7的引物，是由序列表中SEQIDNO:13和SEQIDNO:14组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattatgcccccttccctgcta-3’SEQIDNo:13；下游引物：5’-tccccgctccctctgg-3’SEQIDNo:14。用于检测NOTCH3基因序列片段8的引物，是由序列表中SEQIDNO:15和SEQIDNO:16组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattactggagtgccgcatctgt-3’SEQIDNo:15；下游引物：5’-ccattgacacacacgcagc-3’SEQIDNo:16。用于检测NOTCH3基因序列片段9的引物，是由序列表中SEQIDNO:17和SEQIDNO:18组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattactcagccgtgtgcttccat-3’SEQIDNo:17；下游引物：5’-gccactcaccagtcttgcc-3’SEQIDNo:18。用于检测NOTCH3基因序列片段10的引物，是由序列表中SEQIDNO:19和SEQIDNO:20组成的引物对。上游引物：5’-agtagaattacctgcgacgaggatgctat-3’SEQIDNo:19；下游引物：5’-tctttcccagcccattcac-3’SEQIDNo:20。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测NOTCH3基因突变的方法及其引物组，具体步骤为：利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的CADASIL相关NOTCH3基因突变位点，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物；采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP（Ion Sphere™ Particles, Ion微球）模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种检测NOTCH3基因突变的方法及其引物组，具体步骤为：利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的CADASIL相关NOTCH3基因突变位点，用PrimerExpressSoftware5.0软件设计PCR引物；采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP（IonSphere™Particles,Ion微球）模板的制备，在IonTorrentPGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。2.如权利要求1所述的一种检测NOTCH3基因突变的方法及其引物组，其特征在于，所述的PCR引物组包括针对19个NOTCH3基因序列片段的引物，其序列分别为：SEQIDNo:1-SEQIDNo:38：5’-agtagaattacctgggctcctggctgat-3’SEQIDNo:1；5’-ggaccactggtggctctga-3’SEQIDNo:2；5’-agtagaattagcccaaccaagccatctc-3’SEQIDNo:3；5’-gccagccaccactgaactct-3’SEQIDNo:4；5’-agtagaattatggaaccgcccgattct-3’SEQIDNo:5；5’-ccaggacagggtgagtttagga-3’SEQIDNo:6；5’-agtagaattacagtcctaaactcaccctgtcc-3’SEQIDNo:7；5’-catccacgtcgcttcgg-3’SEQIDNo:8；5’-agtagaattagatgagtgtcgggtgggtg-3’SEQIDNo:9；5’-ccgtggggttctcacatagt-3’SEQIDNo:10；5’-agtagaattacaggaccactatgtgagaaccc-3’SEQIDNo:11；5’-cccacccctctgactctcc-3’SEQIDNo:12；5’-agtagaattatgcccccttccctgcta-3’SEQIDNo:13；5’-tccccgctccctctgg-3’SEQIDNo:14；5’-agtagaattactggagtgccgcatctgt-3’SEQIDNo:15；5’-ccattgacacacacgcagc-3’SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：裘敏燕，
申请(专利权)人：上海联吉医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31