本发明专利技术公开了一种通过LC‑MS检测基因单核苷酸多态性的方法及其应用，包括如下步骤：(1)针对目标基因序列的SNP位点设计特异性扩增引物；(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段；(3)利用碱性磷酸酶消化去除PCR体系中的dNTP；(4)进行单碱基延伸反应；(5)进行脱盐纯化处理；(6)通过质谱仪检测的分子量分析特定SNP位点的基因型。本方法在检测效率上比其他目前常用的检测方法高，一针进样可以完成数十个SNP位点的基因分型；检测准确性高，可以与金标准Sanger测序法相媲美，同时可以检测出样本中的三等位SNP位点的存在，结果可重现性高。
Detection of gene single nucleotide polymorphism by LC-MS and its application
【技术实现步骤摘要】
通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法及其应用
本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种通过PCR-液相色谱-质谱联用(PCR-LC-MS)方法检测基因单核苷酸多态性的方法及其应用。
技术介绍
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的80％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。单核苷酸多态性在遗传性、感染性及肿瘤等疾病的辅助诊断、用药指导等多方面有着极其重要的作用。目前常用的检测基因SNP位点的方法有PCR-直接测序法、PCR-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)、PCR-基因芯片法、荧光定量PCR法、高通量测序法等，这些技术在基因分型和基因突变检测中有着广泛的应用。PCR-直接测序法是公认的检测基因分型的金标准，但检测周期长、检测通量低、灵敏度低、成本较高、对试剂和仪器有特殊要求，不易普及。PCR-限制性片段长度多态性分析法检测灵敏度同样不高、通量低、操作步骤繁琐、只适用于部分SNP位点分型，检测的结果仍需进行一代测序法的再次验证，尤其当样本量多时极易造成PCR产物的交叉污染，且容易出现酶切不充分或酶切过度，从而造成假阴性或假阳性结果。PCR-基因芯片法通量高，但检测结果的准确性和重复性均较差，灵敏度低，成本高，需要特殊的仪器设备，并且操作复杂。荧光定量PCR的检测方法虽然具有灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，结果重复性好，所用仪器容易普及推广等优点，是检测SNP位点的一种非常好的手段，但该方法通量有限，无法方便快捷地满足临床对于多基因的数十个至数百个位点检测的需求，并且探针成本较高，所以主要适于对少量位点、大样本进行分型。高通量测序虽然通量极高，但其成本、耗时、人员需求等不适用于基因SNP位点的检测。因此，急需找到一种简便易行、准确性高、成本低廉、自动化程度高的基因分型方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法及其应用，通过将PCR扩增技术、磷酸酶处理技术和液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术相结合，可以灵敏、特异、简便的对目标基因的SNP位点进行基因分型。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：一种通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法(基因分型方法)，包括如下步骤：(1)针对目标基因序列的SNP位点设计特异性扩增引物；(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段；(3)利用碱性磷酸酶消化去除PCR体系中的dNTP；(4)进行单碱基延伸反应；(5)进行脱盐纯化处理；(6)通过质谱仪检测的分子量分析特定SNP位点的基因型。该方法主要基于多重PCR和单碱基延伸PCR技术，其原理是通过能够特异性扩增包含SNP位点区域的目标基因片段的引物和DNA聚合酶系进行PCR扩增，PCR结束后加入碱性磷酸酶消化处理，去除反应液中的dNTP。之后，在反应液中加入SNP位点特异的延伸引物及ddNTP等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中，SNP位点特异的延伸引物能够与待测的SNP位点的5’端进行特异结合并根据碱基互补配对原则延伸出与目标SNP基因型互补的碱基，根据不同的基因型的DNA模板可得到不用的延伸产物。不同碱基的分子量不同，根据延伸产物的分子量能够确定所分析SNP位点的基因型。所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增一个或者多个目标基因的SNP位点的特异性引物对，所述每个扩增目标基因的SNP位点的特异性引物对包含一条正向引物和一条反向引物。所述步骤(2)中单管多重PCR扩增的反应程序为：90-98℃热启动，30秒-10分钟；90-95℃变性，10秒-1分钟；50-60℃退火，10秒-1分钟；68-72℃延伸，30秒-10分钟；扩增25-45个循环；68-72℃终延伸，5分钟。所述步骤(3)中的碱性磷酸酶进行消化处理的条件为：30-40℃消化处理10-60分钟，70-85℃加热变性5-30分钟，2-8℃终止。所述步骤(3)中的碱性磷酸酶选自虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、大鼠碱性磷酸酶等不同来源的碱性磷酸酶中的任意一种。所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括目标基因的SNP位点的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物包含一条单碱基延伸正向引物或一条单碱基延伸反向引物。所述步骤(4)中单碱基延伸反应程序为：90-98℃热启动，30秒-10分钟；90-98℃变性，5秒；50-58℃退火，5秒；65-85℃延伸，5秒；扩增40个循环；68-75℃终延伸，1-10分钟。所述步骤(5)中的脱盐方式为树脂脱盐。还可包括层析、超滤等任意去除溶液中盐离子的方式。通过去除PCR反应体系中的K+、Na+、Mg2+等离子，防止其干扰质谱检测结果。所述步骤(6)中的质谱仪器为液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)检测系统。还可包括基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)等其它类型的能够检测核酸分子量的质谱类仪器。经过脱盐处理后的反应液上机进行液相分离、质谱检测并得到图谱。由于各延伸产物的分子量不同，因此在各自的分子量(质荷比)位置查看是否出现检测峰，然后判断该样本的SNP分型。LC-MS质谱平台特异性良好，最低检测下限为5ng基因组DNA，对比试验选择的金标准技术Sanger测序技术，符合性为100％。本专利技术还提供了上述通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法在核苷酸多态性检测上的应用。上述基于质谱方法检测单核苷酸多态性方法在SNP检测上的应用可以特异、简便、高通量的对目标基因的SNP位点进行分型，大大的提高基因分型检测效率，降低检测成本。同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：(1)本专利技术方法在检测效率上比其他目前常用的检测方法高，一针进样可以完成数十个SNP位点的基因分型，是基因分型的理想工具。(2)本专利技术方法检测准确性高，可以与金标准Sanger测序法相媲美，同时可以检测出样本中的三等位SNP位点的存在，结果可重现性高。(3)本专利技术方法对于数十个SNP位点的检测性价比高，适合多种用户批量检测的要求。(4)本专利技术方法实验流程简单、人员操作时间短，实验自动化程度高，是进行单核苷酸多态性基因分型的理想工具。下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法及其应用作进一步说明。附图说明图1-图4为LC-MS色谱-质谱分析图。具体实施方式实施例1利用LC-MS检测基因单核苷酸多态性的基因分型方法检测药物基因CYP1A2和UGT1A9的基因多态性(1)人类基因组DNA提取用口腔拭子收集的口腔脱落细胞或收集的新鲜外周血样本采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。(2)引物设计针对CYP1A2基因的rs2069514位点和UGT1A9基因的rs2741049位点进行SNP位点的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过LC‑MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对目标基因序列的SNP位点设计特异性扩增引物；(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段；(3)利用碱性磷酸酶消化去除PCR体系中的dNTP；(4)进行单碱基延伸反应；(5)进行脱盐纯化处理；(6)通过质谱仪检测的分子量分析特定SNP位点的基因型。
【技术特征摘要】
1.一种通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对目标基因序列的SNP位点设计特异性扩增引物；(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段；(3)利用碱性磷酸酶消化去除PCR体系中的dNTP；(4)进行单碱基延伸反应；(5)进行脱盐纯化处理；(6)通过质谱仪检测的分子量分析特定SNP位点的基因型。2.根据权利要求1所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增一个或者多个目标基因的SNP位点的特异性引物对，所述每个扩增目标基因的SNP位点的特异性引物对包含一条正向引物和一条反向引物。3.根据权利要求1所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(2)中单管多重PCR扩增的反应程序为：90-98℃热启动，30秒-10分钟；90-95℃变性，10秒-1分钟；50-60℃退火，10秒-1分钟；68-72℃延伸，30秒-10分钟；扩增25-45个循环；68-72℃终延伸，5分钟。4.根据权利要求1所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的碱性磷酸酶进行消化处理的条件为：30-40℃消化处理10-60分钟，70-85℃加热变性5-30分钟，2-8℃终止。5.根据权利要求1所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的碱性磷酸酶选自虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。6.根据权利要求1所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括目标基因的SNP位点的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物包含一条单碱基延伸正向引物或一条单碱基延伸反向引物。7.根据权利要求1所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述步骤(4)中单碱基延伸反应程序为：90-98℃热启动，30秒-10分钟；90-98℃变性，5秒；50-58℃退火，5秒；65-85℃延伸，5秒；扩增40个循环；68-75℃终延伸，1-10分钟。8.根据权利要求1所述的通过LC-MS检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵方圆，佟洪梅，智慧芳，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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