本发明专利技术公开了一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用。以待测山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊CMTM2基因部分片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14‑bp插入/缺失多态性位点的基因型。相关分析结果发现，山羊CMTM2基因的14‑bp插入/缺失多态性的不同基因型与陕北白绒山羊的产羔数性状存在显著相关关系，存在提高山羊产羔数性状的DNA标记。本发明专利技术提供的检测山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的方法，可应用于山羊分子标记辅助选择育种中，加快建立优良山羊遗传资源群体。
Detection of CMTM2 gene insertion/deletion polymorphism in goats and its application
【技术实现步骤摘要】
一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
本专利技术属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14-bp插入/缺失多态性(InDel)位点的快速、准确分型检测及其在分子标记辅助选择(MAS)育种中的应用。
技术介绍
近些年来随着生物技术的迅速发展，人们利用高通量测序、分子标记等先进生物技术和信息技术手段，建立起了常规育种与分子育种相结合的平台，使育种工作实现了由经验向科学的根本性转变，大幅度的提高了育种效率。自1950年以来，畜禽育种工作取得了巨大的进展，数量遗传理论逐步形成了主要育种手段，被应用到动物育种实践中，畜牧生产水平也得到了极大的提高。进入20世纪80年代以来，畜禽遗传改良的速度呈现了变慢的趋势，虽然经历了相对长期的选择，但是急需寻求一种突破性的育种方法。在这一时期中，以分子数量遗传学为理论基础的分析育种方法应运而生。随着分子生物学等技术的发展，DNA分子标记逐渐产生，使畜禽数量性状图谱越来越系统和完善，即分子遗传标记技术的成熟。一些数量性状位点的确定，为畜禽改良提供了新的有效手段，与经济性状关联的DNA分子标记和功能基因的挖掘，为如何利用分子遗传标记对数量性状基因型进行辅助选择提供了新思路。从基因型水平上，分子标记辅助育种通过寻找与重要性状紧密连锁的DNA分子标记，加快了育种进程，实现了对目标性状的直接选择，提高了育种效率。畜禽遗传改良的多数目标性状都是数量性状，标记辅助选择可以提高畜禽育种效率(薛梅2015)。插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的改变，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的DNA片段。与SNP相比，InDel均是源于单突变事件，其突变频率较低，相对比较稳定，在结构上属于二等位基因多态性，能够通过很小的扩增子(<50bp)进行扩增。InDel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失；(2)单一碱基的插入/缺失；(3)重复单元为2～15个碱基的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入/缺失；(5)任意DNA序列的插入/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，InDel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点。InDel多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的基因组研究中，在畜禽上则集中在对鸡生长性状的研究，在反刍动物上研究和应用甚少。由此，对反刍家畜的功能性基因的InDel标记研究亟待开拓和深入。随着人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，但近年来羊肉、羊奶、羊绒等羊产品严重短缺。在高产、优质和高效的山羊育种目标上，通过对在DNA水平上筛查的与山羊产羔数性状密切相关的DNA标记进行基因多态性的检测，以及基因多态性与产羔数性状的关联分析，从而利用MAS加快建立优良产羔数性状山羊种群一直是关注热点。山羊CMTM2基因位于18号染色体上，具有4个外显子与3个内含子，长度约为2.2kb，其cDNA可以编码248个氨基酸的完整开放阅读框。CMTM2蛋白存在着跨膜与分泌两种形式，其结构与功能介于趋化因子与四次跨膜蛋白之间，具有极强的疏水性。此外还含有如LXXLL、FXXLY和FXXFF等可以与雄激素受体(AndrogenReceptor，AR)相结合的模体结构(Liuetal.,2009)。CMTM2的异常表达与精子发生缺陷密切相关，随着精子发生缺陷的加重，支持细胞综合征(SCOS)患者睾丸CMTM2阳性细胞数量和mRNA水平明显下降，甚至无表达，组织学特征为睾丸小管生殖上皮完全丧失(Liuetal.,2007)。CMTM2基因的表达具有组织特异性，仅在少数几种组织中表达，如睾丸、卵巢、胎盘、外周血细胞等，其中在睾丸中可以高度表达(Shietal.,2005)。但是，目前尚未见到关于CMTM2基因InDel位点及其与产羔数性状存在显著相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，可以快速建立优良性状的山羊遗传资源群体。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为扩增引物，利用PCR扩增包含山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态性位点的片段，对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定待测山羊个体在所述插入/缺失多态性位点的基因型。优选的，所述插入/缺失多态性位点选自山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14-bp插入/缺失多态性位点。优选的，所述引物对P1为：上游引物：5'-AGTGCCCTTTTCTCCTCCTA-3'(20nt)；下游引物：5'-TGACCCTCCACTACCTCTTT-3'(20nt)。优选的，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，25个循环；72℃延伸10min。优选的，所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。优选的，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为145bp一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为145bp和131bp两条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为131bp一条带纹。一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增上述山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态位点的引物对(例如，上述引物对P1)。上述山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。优选的，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)可以作为提高山羊产羔数的DNA标记。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术根据山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态性位点(参考序列NC_030825.1:g.35582961_35582974delTGGTAATGCCCCAA)设计引物，以山羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。本专利技术对山羊(例如，陕北白绒山羊)CMTM2基因插入/缺失多态性位点(参考序列NC_030825.1:g.35582961_35582974delTGGTAATGCCCCAA)进行基因型和基因频率分析，对该插入/缺失多态性位点与山羊生产性状进行关联分析，结果表明本专利技术检测的插入/缺失多态性位点能够作为山羊产羔数的分子标记位点，从而加快建立产羔数性状优良的山羊种群，提高良种选育速度。附图说明图1为山羊CMTM2基因扩增产物(引物对P1)的琼脂糖凝胶电泳结果；M表示Marker。图2为山羊CMTM2基因PCR扩增产物测序图，其中：黑色方框标出的部分表示14-bp缺失序列：NC_030825.1:g.35582961_35582974delTGGTAATGCCCCAA。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测山羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型。
【技术特征摘要】
1.一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测山羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型。2.根据权利要求1所述一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点选自山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14-bp插入/缺失多态性位点。3.根据权利要求1所述一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的引物对为：上游引物：5'-AGTGCCCTTTTCTCCTCCTA-3'；下游引物：5'-TGACCCTCCACTACCTCTTT-3'。4.根据权利要求1所述一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。5.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：蓝贤勇，康自红，何礼邦，潘传英，陈宏，宋晓越，朱海鲸，闫海龙，屈雷，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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