多态性检测方法技术

一种用于检测样品中核酸序列内某一特定位置是否存在多态性的方法，该方法包括：ｉ）在基本不含有ＡＴＰ的反应混合物中，使一对探针与该核酸序列退火，该对探针被设计为在退火时相互邻近，并且仅同一种形式的序列完全退火；ｉｉ）在ＮＡＤ和核酸连接酶存在时，将任何完全退火的成对探针连接起来，该连接酶以ＮＡＤ为底物；ｉｉｉ）将连接事件中释放的任何ＡＭＰ磷酸化成ＡＴＰ；ｉｖ）在得到的反应混合物中检测ＡＴＰ，特别是使用生物发光反应。对实施该方法的试剂盒也进行了描述，并提出了权利要求。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种用于一全测特定核酸序列的方法，该方法尤其适用于 鉴定含有多态性或突变的序列，此外，本专利技术还涉及实施此类分析的试剂盒。越来越多的不同方法能用于检测特定的核酸序列，尤其是用于测定 核酸的精确序列。在这些方法中，很多是基于核酸扩增反应，比如多聚酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)。这些方法用于种类繁多的方法中以检测或诊断例如由于诸如细菌 和病毒等病原导致的疾病。这些方法还尤其适用于存在多态性的遗传分析或诊断，所以多态性尤其是能够导致疾病状态、或者能导致特定疾病 状态倾向(predisposition)的单核苷酸多态性(SNPs )。随着人类基因组测序的完成，以及日益增多的关于特定多态性和特 定疾病或特定疾病倾向之间关系的知识，正在进^亍的以i貪断为目的的分 析数量也日益增加。连接酶链反应是一种特别有用的检测多态性的方法。在该反应中， 将一对互补探针加入到待测试样品中，该对探针在合适模板存在的情况 下能在模板上相互杂交。在此种杂交可发生的条件下，它们进行杂交， 然后在核苷酸存在的情况下，使用连接酶进行连接，该核苷酸通常为三 磷酸腺苷(ATP),但尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)也可以使用。在该过程中，发生了三步连接事件，例如在J.M. Pascal等的文章 中有实例说明，在每一个连接事件中，有 一分子的单磷酸腺苷(AMP)作为副产物被释放出来。被连接的探针和原始模板然后充当另 一轮杂交和连接的另外的模 板。这通过以下来实现，首先对混合物加热，使核酸《连发生变性，例如， 加热到8 0 - 9 0 。C的温度，合适的温度为8 5 。C左右；随后，将混合 物冷却到一定温度，例如4 0 - 6 0 。C,典型的温度为5 0 。C左右，此 时探针退火，连接发生。当随后的循环进行时，只有样品中包含合适模 板时才能得到扩增。通过使用4个探针，每一对探针对应于原始双链模板分子的一条 链，可以导致指数扩增的发生。在这种情况下，在起始步骤要对双链 DNA模板进行变性。靠近，但相互之间并不直接毗邻。在这种情况下，还需要在反应混合物 中加入使上游探针延伸通过探针之间小的缺口 (一般为2 - 3碱基对) 所必需的聚合酶、核苷酸和其它试剂，使得在连接之前上游探针(其随 后作为聚合酶延伸反应的引物)能延伸通过该缺口。只有在上游探针的 3'端碱基和模板的相应碱基匹配的情况下，延伸反应才会发生。如果 不匹配，例如因多态性或类似原因所致，随后的连接反应将不会发生。随后，探针连接的产物可以通过根据大小分离产物，例如在电泳凝 胶上，并对凝胶染色以检测它们来进行检测。对应于已连接探针的条带 要比单一的探针大，因此，出现这样的条带就表明连接反应已经发生， 在样品中有合适的模板存在。但是，该分离步骤和检测步骤完成起来比较慢，而且复杂。只有在 试验室条件下才能进行，对操作者的操作技能水平要求高，并且需要好 几个单独的反应阶段。在某些情况下，在反应混合物中可能会加入同双链DNA结合的荧改变。如^扩增反应已经进行，就会通^t染料的萸光信^特性检测出 来。但在这种情况下，需要使用荧光计才能检测到信号，荧光计是一种 相对复杂的仪器。必须为样品提供特定波长的萸光，然后对不同波长的 发射信号进行检测。根据本专利技术，提供了 一种用于检测样品核酸序列中特定位置上是否 存在多态性的方法，该方法包4舌i) 在基本不含有ATP的反应混合物中，使一对探针与该核酸序列 退火，该对探针被设计为在退火时能相互邻近，并且仅能对一种形式的 序列完全退火；ii) 在NAD和核酸连接酶存在时，将任何完全退火的成对探针连接 起来，该连接酶以NAD为底物；iii) 将连接事件中释放的任何AMP磷酸化成ATP; iv )在得到的反应混合物中4全测ATP。步骤(i)可以釆用此类反应的常规方法进行。至此，如果探针的相 邻末端同模板完全匹配，探针就会以直接相互毗邻的方式结合在模板链 上，导致步骤(11)中连接反应的发生。或者，探针可以结合使得二者之间会有一小的缺口，前提是在该缺 口区域没有腺。票呤碱基。在这种情况下，反应混合物中包含必需的聚合 酶、腺。票呤以外的核苷酸和任何其它试剂，从而只有在探针的3，端能 够和模板的对应碱基完全匹配的情况下，使上游引物延伸填补此缺口 ， 并允许连接发生。如果该碱基不匹配，则探针不能延伸填补缺口，步骤(ii)的连接反应就不会发生。使用这种方法，只有样品中包含有两个探针都能完全结合的序列 时，步骤(11)的连接反应才会发生。在步骤(iv),通过片全测ATP,就可以测定是否有导致此种匹配的 核酸序列存在，该ATP来源于连接反应中所释放的AMP。如果形成检测靶标的核酸序列中发生突变或变化，尤其是在探针相 互毗邻结合的位置出现这种情况时，其中 一个探针的末端不能和靶序列 结合，则步骤(ii)的连接事件就不会发生。结果就没有AMP产生，而 步骤(iii)的磷酸化也不会产生任何ATP。在步骤(iv)的反应混合物 中缺乏ATP则表明，样品中不包含靶核酸，因此可能存在不同的形式。能够以NAD和ATP或者代替ATP作为底物的核酸连4妄酶是已知 的。这种连接酶的一个特殊例子是Eco/z'连纟妄酶。连接反应的副产物AMP可以在步骤(iii)中通过酶促反应直接磷 酸化成ATP，或者通过产生二磷酸腺苷(ADP)的途径而磷酸化成ATP。用于将产生的AMP转化成ATP(上述步骤(iii))的一种或多种酶可 以选自，例如磷酸烯醇式丙酮酸合酶，该酶在-岸酸和磷酸烯醇式丙酮酸 存在时能由AMP直接产生ATP,磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸也要作为试 剂被加入到反应混合物中。另一种选择是，三磷酸核苷-腺苷酸激酶和 NTP的组合会产生二磷酸腺苷(ADP),后者在包含或加入像腺普酸激酶 的酶时会转化为ATP。其它适合的酶的实例包括，比如Eisaki等在Biochem. et Biophys Acta 1431(1999) 363-373中描述的丙酮酸石粦酸二激酶。通过使用NAD替代常规用于LCR的ATP ,可以使用基于ATP检 测的信号系统的可能性增加了 。关于该类型反应的系统已经知道很多种。但是这些反应系统一般能 快速进行，可以《会出，例如清晰的可见的原位信号。因此，可以以均质的方式对连接反应进行测定，而不需要对连接产物的大小进4于分析。尤其是可以使用生物发光系统对ATP进行检测。使用此类检测系统 的实例，例如在WO 96/02665中有描述。能和存在的ATP反应的特别合适的生物发光试剂包括荧光素和荧 光素酶，在需要的情况下还伴有镁离子源，例如醋酸镁。在ATP存在时， 这些试剂产生发光信号，其可以很容易地被监测到，例如使用常规的发 光检测仪设备。这些操作和应用起来一般要比荧光计更筒单。在产生信号的时候，这些试剂重新产生了 AMP分子，在存在步骤 (in)的酶和/或试剂时，AMP可以重新被转化成ATP。因此信号就以 指数形式积累，可以很容易和快速地被检测到。Sakakibara等在 Analytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999)中描述了这种系统的一个实 例。这种信号的指数增长意味着可以直接进行检测，而这种情况在以前 则可能需要扩增反应。生物发光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测样品中靶核酸序列内特定位置上是否存在多态性的方法，该方法包括ｉ）在基本不含有ＡＴＰ的反应混合物中，使一对探针与该核酸序列退火，该探针被设计为在退火时相互邻近，并且仅与一种形式的序列完全退火；ｉｉ）在ＮＡＤ和核酸连接酶存在时，将任何完全退火的成对探针连接起来，该核酸连接酶以ＮＡＤ为底物；ｉｉｉ）将连接事件中释放的任何ＡＭＰ磷酸化成ＡＴＰ；和ｉｖ）在得到的反应混合物中检测ＡＴＰ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DJ斯奎雷尔，
申请(专利权)人：恩尼格马诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]