用于检测基因融合的多重PCR方法、试剂盒和组合物技术

本发明专利技术涉及用于检测基因融合的多重PCR方法、试剂盒和组合物。用于在分离的基因组DNA中检测至少两个已知的基因融合的存在或不存在的方法，包括使用分离的基因组DNA进行多重PCR。对于每种已知的基因融合，多重PCR使用一个或多个正向引物杂交第一个基因中邻近其融合断裂点位置，并且一个或多个反向引物杂交第二个基因中邻近其融合断裂点位置。引物杂交到相应基因上由多个碱基对隔开的连续隔开的相应位置。检测到的扩增产品分别表示基因融合体的存在。扩增产物可以通过Sanger测序以确定融合断点。通过设计的融合PCR监测鉴定的特异性融合。靶向治疗期间在患者血浆游离DNA中采用多重突变的实时PCR来检测抗药性突变，例如，酪氨酸激酶抑制剂的靶向治疗,来指导二线和三线的靶向治疗。

【技术实现步骤摘要】
用于检测基因融合的多重PCR方法、试剂盒和组合物
本专利技术涉及的方法是用于检测组织样品中是否存在一种或多种已知的基因融合，用于在血清样品中监测检测到的基因融合体，和获得的耐药突变的方法。所述方法，试剂盒和组成物有利于帮助个体患者(例如癌症患者)选择合适的靶向疗法。
技术介绍
基于患者中的一种或多种遗传改变的靶向疗法的开发正在增加。因此，非常需要用于筛选个体患者进行遗传改变的有效且可靠的方法。肺癌是美国癌症相关死亡的主要原因。大约85％的肺癌是非小细胞肺(NSCLC)，主要包括鳞状细胞癌，腺癌，腺鳞癌和大细胞未分化癌，绝大多数是腺癌。大多数NSCLC被诊断为晚期，具有临床侵袭性，并具有高转移潜力。另外，目前的NSCLC化学治疗方案具有低效力。例如，未经治疗的晚期NSCLC患者的中位生存期为7-15个月，而目前基于铂的双重化疗方案治疗的患者中位生存期为8-12个月。对NSCLC的癌发生和恶性进展机制的研究已经揭示了在该人类恶性肿瘤中不同的驱动基因被改变，并且已经开发了基于NSCLC肿瘤中的某些驱动突变的靶向治疗。识别与非鳞状NSCLC相关的致癌基因突变可以帮助确定哪些患者更有可能从靶向治疗中获益。这些癌基因包括EGFR，KRAS，BRAF，PIK3CA，ROS1并且ALK，ROS1和EGFR突变的分子诊断测试现在推荐用于NSCLC的指导治疗。在大约2-7％的NSCLC腺癌患者中观察到棘皮动物微管相关蛋白如4(EML4)和ALK之间的融合。这种和其他ALK基因融合在非吸烟者或轻度吸烟者的腺癌患者中更常见。由于EGFR，ROS1和ALK突变是相互排斥的，因此ALK重排(基因融合)的患者不会受益于针对其他突变的治疗。例如，EGFR靶向酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)。取而代之的是，用ALK抑制剂如克唑替尼(Xalkori)，色瑞替尼(Zykadia)，或布格替尼(Alunbrig)进行治疗。在接受克唑替尼作为二线治疗的患者中，一年总生存率为70％，两年总生存率为55％。相比之下，ALK阳性匹配对照组的一年生存率为44％，两年生存率为12％，而ALK阴性对照组的一年生存率为47％，两年生存率为32％。这些数据表明，ALK基因融合本身的存在并不会产生较差的结果，但在ALK阳性患者中使用克唑替尼可以改善预后。Kwak等，非小细胞肺癌中的间变性淋巴瘤激酶抑制。NEnglJMed.，363(18)：1693-1703(2010)；Crinò等，初步II期结果与克唑替尼治疗晚期ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)：PROFILE1005，JClinOncol.，29(增刊15)：摘要7514(2011)；Shaw等，Ceritinib在ALK重排的非小细胞肺癌中，NEnglJMed.，370(13)：1189-1197(2014)。基于这样的数据，建议在转移性非小细胞肺癌腺癌测试ALK重排，和建议ALK抑制剂克唑替尼用于ALK基因融合阳性患者。类似地，原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS(ROS1)是一种孤儿受体酪氨酸激酶(RTK)，其形成融合并定义NSCLC中另一种临床上可操作的致癌驱动突变。最近报道，大约1.4％的NSCLC具有ROS1重排。在ROS1融合阳性肿瘤中，已知30％具有复发性易位[5；6][q32；q22]，其产生CD74分子，主要组织相容性复合物，二类不变链(CD74)-ROS1融合激酶。ROS1在进化上和ALK相关，并且据此ALK抑制剂也可以在ROS1融合阳性癌症中使用。在30-50％的散发性甲状腺髓样癌中观察到体细胞获得功能RET突变，并且在30-50％的散发性乳头状甲状腺癌中观察到体细胞RET基因融合。美国食品和药物管理局(FDA)已批准了两种抑制药凡德他尼(ZD6474)和卡博替尼(XL184)用于晚期的甲状腺髓样癌的治疗。RET融合存在于1-2％的具有亚洲和欧洲血统的NSCLC腺癌患者中。一些研究表明RET融合优先发生在年轻的非吸烟者和轻度吸烟者中。这些实施例证明了确定癌症个体是否具有一种或多种基因融合的价值，所述基因融合将影响特定治疗的有效性，特别是在诸如NSCLC的癌症的治疗中。荧光原位杂交(FISH)是目前ALK融合的参考检测方法。该技术使用两种特异性DNA探针，每种探针偶联荧光标记，一种绿色和一种红色，覆盖2p23ALK区域。在野生型场景中，红色信号(3'ALK)和绿色信号(5'ALK)相邻。当这两个信号之间的距离大于信号直径的两倍时，它们被认为是分离的，反映了两个DNA区域的物理分离，因此是易位(基因融合)。如果在四个视野中计数的>15％的肿瘤细胞显示绿色和红色信号之间的分离或者是丢失相关的绿色信号的单个红色信号，则FISH认为是易位阳性的。该15％阈值允许由于背景噪声，读数或异常杂交引起的错误。必须计数至少50个细胞，如果存在10％至50％的阳性细胞，则由第二个读者计数另外50个细胞。FISH的优势在于无论变体或融合蛋白如何都能检测ALK重排，以及其与临床功效的相关性。它已被美国FDA批准用于克唑替尼治疗(VysisALK分离FISH探针试剂盒；雅培分子公司，德斯普兰斯，伊利诺伊斯，美国)。然而，使用FISH分析检测ALK易位可能具有挑战性：1)该技术相对昂贵，2)对结果的准确解释需要经过培训的细胞学家的专业知识和经验，他们必须查看多个组织切片的测试，3)技术没有确定具体的易位类型，4)技术通常有一个漫长的周转时间。免疫组织化学(IHC)是检测肺癌中ALK重排的另一种方法。最初，IHC遇到了敏感性问题，偶尔会出现假阳性结果。但是，新的超灵敏IHC技术似乎提供了更可靠的和敏感的检查方法。阳性阈值通常是视觉的，需要在5-10％的细胞中进行中度至强烈染色。IHC的优点主要是其在时间和人力方面的低成本，但是测试的标准化是困难的。在NSCLC中开发用于ALK检测的IHC的挑战是：1)组织制备，2)抗体选择，3)信号增强系统，和4)最佳评分系统。虽然IHC是一种可靠的筛查工具，但在IHC阳性的情况下需要进行FISH确认，甚至在某些情况下，IHC阴性患者呈现预测性的重排包括年龄较小，轻度吸烟者(≤10包年)也需要FISH确认。阴性要做其他突变检测，特别是EGFR和KRAS。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和定量RT-PCR(QRT-PCR)也被用作ALK易位诊断技术。通常，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，并用特异性引物PCR扩增cDNA。参见，例如，Sanders等人，US9.175.350B2和Begovich等人，US2016/0304937A1。扩增需要特异于每个易位的引物组。这种高度特异性的技术提供了鉴定与ALK相关的融合基因的额外优势。其用途迄今为止有限是于从一个福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)组织样品或来自新鲜或冷冻的肿瘤组织RNA的样品质量。另外，由于基因融合的高度可变性，通过RT-PCR或qRT-PCR检测融合基因可能不成功。因此，需要一种用于检测基因融合的简单，高通量方法，包括但不限于涉及ALK，ROS1，RET和NRTK1易位的方法。根据本专利技术的方法检测易位尤其可用于靶向治疗。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供用于检测基因融合体，其中包括提供一种简单的，高通量的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测组织样品中是否存在至少两种已知的基因融合的方法，其中每种基因融合在第一融合断点位置的相应的第一基因和第二融合断点位置的相应的第二基因之间形成，所述方法包括(a)提供从组织样品中分离的基因组DNA，(b)对分离的基因组DNA进行多重PCR，其中，对于每种已知的基因融合，多重PCR使用一个或多个正向引物和一个或多个反向引物，所述正向引物与邻近第一融合断点位置的相应的第一基因杂交，其中多个正向引物与沿着第一基因的连续的相应位置的相应的第一基因杂交，并且通过第一多碱基对将彼此分开，并且所述反向引物与邻近第二融合断点位置的相应的第二基因杂交，其中多个反向引物与沿着第二基因的连续的相应位置的相应的第二基因杂交并且通过第二多碱基对将彼此分开，以及(c)检测是否形成一种或多种扩增产物，每种扩增产物分别代表基因融合的存在。

【技术特征摘要】
2017.12.19 US 62/607,7391.一种用于检测组织样品中是否存在至少两种已知的基因融合的方法，其中每种基因融合在第一融合断点位置的相应的第一基因和第二融合断点位置的相应的第二基因之间形成，所述方法包括(a)提供从组织样品中分离的基因组DNA，(b)对分离的基因组DNA进行多重PCR，其中，对于每种已知的基因融合，多重PCR使用一个或多个正向引物和一个或多个反向引物，所述正向引物与邻近第一融合断点位置的相应的第一基因杂交，其中多个正向引物与沿着第一基因的连续的相应位置的相应的第一基因杂交，并且通过第一多碱基对将彼此分开，并且所述反向引物与邻近第二融合断点位置的相应的第二基因杂交，其中多个反向引物与沿着第二基因的连续的相应位置的相应的第二基因杂交并且通过第二多碱基对将彼此分开，以及(c)检测是否形成一种或多种扩增产物，每种扩增产物分别代表基因融合的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多碱基对和所述第二多碱基对各自为约0.1至约4kb，约0.25至约3kb，或约0.5至约2kb。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多碱基对和所述第二多碱基对各自为约0.5至约1kb。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，用于检测组织样品中三种或更多种已知基因融合是否存在。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中相应的基因融合的第一基因选自由以下各项组成的组：EML4，KIF5B，KLC1，TGF，SEC31A，TPR，SQSTM1，DCTN1，STRN，PPFIBP1和HIP1并且相应的基因融合的第二基因是ALK。6.根据权利要求5所述的方法，其中相应的基因融合的第一融合断裂点位置选自由以下各项组成的组：EML4内含子2，EML4内含子6，EML4内含子13，EML4内含子14，EML4内含子15，EML4内含子18，EML4内含子17，EML4内含子20，KIF5B内含子24，KIF5B内含子17，KIF5B内含子15，KLC1内含子9，TFG内含子3，SEC31A内含子21，TPR内含子15，SQSTM1内含子5，DCTN1内含子26，STRN内含子3，PPFIBP1内含子8，PPFIBP1内含子12，HIP1内含子21，HIP1内含子28，和HIP1内含子30，和相应的基因融合的第二融合断点位置是ALK内含子19。7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中相应的基因融合的第一基因选自由以下各项组成的组：slc34a2，SDC4，CD74，EZR，LRIG3，TPM3，GOPC，和CCDC6，和相应的基因融合的第二基因是ROS1。8.根据权利要求7所述的方法，其中相应的基因融合的第一融合断点位置选自由以下各项组成的组：slc34a2内含子4，slc34a2内含子12，SDC4内含子2，SDC4内含子4，CD74内含子6，EZR内含子10，LRIG3内含子16，TPM3内含子2，TPM3内含子8，GOPC内含子4，GOPC内含子8，和CCDC6内含子6，以及相应的基因融合的第二融合断点位置选自由以下各项组成的组：ROS1内含子31，ROS1内含子33，和ROS1内含子34。9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中相应的基因融合的第一基因选自由以下各项组成的组：KIF5B，TRIM33，NCOA4和CUX1，并且相应的基因融合的第二基因是RET。10.根据权利要求9所述的方法，其中相应的基因融合的第一融合断点位置选自由以下各项组成的组：KIF5B内含子15，KIF5B内含子16，KIF5B内含子23，KIF5B内含子24，TRIM33内含子14，NCOA4内含子6和CUX1内含子19，并且相应的基因融合的第二融合断点位置选自由以下各项组成的组：RET内含子11，RET内含子10和RET内含子7。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，用于检测至少三个或更多个基因融合是否存在，其中执行根据步骤(c)的两个或更多个多重PCR，并且其中用于相应的已知的基因融合的引物在多重PCR中分开，以最小化引物之间的二聚体形成。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中检测至少一个扩增产物，所述方法还包括(d)使从所述组织样品中分离的基因组DNA进行针对每个基因融合的单独PCR，对于该基因融合在步骤(b)使用正向引物和反向引物，相应的单独PCR使用针对相应的基因融合在多重PCR中所使用的正向引物和反向引物；和(e)在每个单独的PCR中，检测是否形成扩增产物，所述扩增产物代表相应的基因融合存在。13.根据权利要求12所述的方法，还包括将步骤(e)中检测的扩增产物测序，和设计在扩增产物的基因融合周围的正向引物和反向引物，其可操作以扩增包含基因融合的片段。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述片段包含约50至约150个碱基对。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中将步骤(e)中检测的扩增产物测序是通过Sanger测序来进行的。16.一种用于评估靶向治疗期间癌症进展或癌症消退方法，包括根据权利要求13-15中任一项所述，确定在患者的组织样品中存在基因融合和设计基因融合周围的正向引物和反向引物，其可操作以扩增包含所述基因融合的片段，和在靶向治疗期间使用PCR中设计的引物监测患者无血浆细胞DNA(cfDNA)中融合产物的量。17.一种用于监测使用可能产生抗药性的药物靶向治疗患者的方法，包括根据权利要求1-15中任一项所述的方法检测在患者的组织样品中是否存在与药物抗性相关的一个或多个获得的功能突变。18.根据权利要求17所述的方法，其中在靶向治疗期间检测与药物抗性相关的一个或多个获得的功能突变是否存在的步骤重复至少一次。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述药物是克唑替尼并且检测与药物抗性相关的一种或多种获得的功能突变是否存在的步骤检测克唑替尼抗性ALK突变和克唑替尼抗性ROS1突变是否存在。20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中，所述基因组DNA是无血浆细胞DNA。21.根据权利要求17所述的方法，其中所述克唑替尼抗性ALK突变选自由以下各项组成的组：1511Tins，L1152R，C1156Y，I1171T，I1171S，F1174V，F1174C，L1196M，L1198F，G1202R，S1206Y和G1269A，及其组合。22.根据权利要求17所述的方法，所述克唑替尼抗性ROS1突变选自：L2026M，G2032R，D2032N，L2155S，S1986Y和S1986F，及其组合。23.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中至少一个已知的基因融合是BCR-ABL1、RBN15-MKL1、NPM1-ALK、IGH-MYC、RUNX1-RUNX1T1、ETV6-RUNX1、IGH-MAF、PML-RARA、FGFR2-KIAA1967、FGFR3-TA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李劲风，郭晓敏，
申请(专利权)人：李劲风，郭晓敏，
类型：发明
国别省市：美国,US