一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒。该等温扩增核酸片段的方法，具体为：采用包括特异性引物对和通用引物对的引物组，补平所述特异性引物对与扩增模板结合后形成的切口，使所述通用引物对以补平产物为模板，在DNA聚合酶催化下等温扩增核酸模板。本发明专利技术提供了一种新的等温扩增核酸片段的方法，该方法适用于双链DNA、单链DNA和RNA扩增。

A method for isothermal amplification of nucleic acid fragments, primers and their applications, and kits for amplification of nucleic acid fragments

【技术实现步骤摘要】
一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒。
技术介绍
核酸扩增是生物体内必不可少的反应,其体外应用产生的技术奠定了现代分子生物学的基础。其中最常用的技术是聚合酶链式反应(PCR)，需要热循环仪在某种程度上制约了PCR的应用。然而等温扩增不需要热循环仪，科研人员基于核酸自然扩增过程开发了很多等温扩增方法，现有方法可分为基于RNA转录的等温扩增方法、基于DNA复制的等温扩增方法、基于链替代反应的等温扩增方法、依赖切刻内切酶的等温扩增技术，这些方法各具优缺点，扩增效率与应用范围也不同，现简述如下。依赖核酸序列的扩增技术(NucleicAcidSequence-basedAmplification，NASBA)，又称自主序列复制(Self-sustainedSequenceReplication，3SR)，是一种典型的基于RNA转录的等温扩增方法，如果模板为DNA需要95℃变性，然后引物1(P1)与单链DNA模板或RNA模板在65℃退火，随后反应在41℃进行，禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AvianMyeloblastosisVirus(AMV)ReverseTranscriptase)、核糖核酸酶H(RNaseH)、T7RNA聚合酶(T7DNAdependentRNApolymerase)与两条引物(P1和P2)在2h左右将模板RNA扩增约109倍，该技术已广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测。NASBA的优点：(1)在RNA病毒诊断中优势明显；(2)可替代RT-PCR进行RNA扩增检测；(3)需要引物的浓度相比PCR低1个数量级；(4)可在基因组DNA大量存在的情况下选择性扩增RNA。NASBA的缺点：(1)不是一个真正的等温扩增反应，需要高温变性或退火；(2)由于反应酶耐热性差需要分别加入；(3)只有120-250bp的靶序列才能有效扩增。信号介导的RNA扩增技术(Signal-mediatedAmplificationofRNATechnology，SMART)也是一种基于RNA转录的等温扩增方法。该反应使用2条单链寡核苷酸探针(Single-strandedOligonucleotideProbes)、1条标记延伸探针(LabelledExtensionProbe)和1条标记模板探针(LabelledTemplateProbe)，延伸探针比模板探针短，但有自由的5’端羟基，用于模板延伸，整个反应需要BstDNA聚合酶与T7RNA聚合酶在相同反应条件下共同作用，产生靶序列依赖信号，该信号可被进一步放大，既可检测DNA又可检测RNA。由于形成经典的Three-wayJunction(3WJ)结构，SMART具有特异性强的优点，并且该方法可耐受各种样品，如基因组DNA、总RNA、粗提样品或大量非靶标基因组DNA存在；SMART的主要缺点是其灵敏度比PCR低，未来SMART的发展趋势是提高灵敏度、开发更有效的结果检测方法以及将扩增反应与结果检测设计在一个反应管中进行。赖解旋酶恒温基因扩增技术(Helicase-dependentAmplification，HDA)是一种基于DNA复制的等温扩增方法，HDA模拟生物体内复制叉，使用解链酶如E.coliUvrDhelicase等解开DNA双链，使用单链结合蛋白SSB等蛋白质防止解开的双链重新结合，并促使两个引物与模板结合，在DNA聚合酶作用下37℃扩增。HDA成功实现了37℃低温扩增基因组DNA，目前HDA的不足之处是反应速度慢，E.coliUvrDhelicase的持续解链能力差，解链酶与DNA聚合酶缺乏协调作用。但由于HDA反应机制简单、反应温度低并且不需要DNA模板变性，最具有POC诊断的应用前景，未来发展趋势是将HDA整合到Lab-on-chip上，包括多步样品处理能力与多通道样品检测能力，实现微型化与自动化。Piepenburg等对HAD进行改进提出了重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术，RPA主要依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶进行常温下的核酸扩增。RPA的扩增效率高，可在37-42℃范围内40-60分钟将模板扩增到109倍，RPA反应机制简单、反应温度低，相比HAD更适合POC诊断，RPA分析的关键在于扩增引物或探针的设计，PCR引物多半是不适用于该技术，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度，RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，需要多次摸索条件进行优化，而且目前还没有设计软件可以使用。Fire等于1995年借鉴微生物环状DNA复制过程提出滚环扩增技术(Rollingcircleamplification，RCA)，是一种基于链替代反应的等温扩增方法。在RCA反应中，phi29DNA聚合酶是至关重要的组成部分，具有持续DNA合成能力和链置换活性。RCA的反应模板通常是单链环状DNA，如果样品是双链环状DNA，需变性处理，如果样品是双链线状DNA，在进行变性处理后，还需用T4多核苷酸激酶与T4DNA连接酶环化单链线状DNA。RCA按引物数量可分为单引物RCA，双引物RCA、多引物RCA以及基于锁式探针的RCA(Padlock-RCA)。与其他核酸扩增方法相比，RCA主要优点为：反应机制简单，仅需一种聚合酶即可实现核酸扩增；灵敏度高，一条引物可达到105倍扩增，而两条引物的扩增效率可达到109倍。RCA的不足之处在于：前处理繁琐，反应模板要求是单链环状DNA，须对不符合要求的样品进行退火和环化处理；反应时间较长，至少需要4小时。环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)也是一种基于链替代反应的等温扩增方法。LAMP的反应过程可分为3个阶段：循环模板合成阶段、循环扩增阶段和伸长再循环阶段。LAMP使用4条引物，分别是正向内引物FIP(包括F1c和F2两部分序列，其中c代表反向互补序列)，反向内引物BIP(包括B1c和B2)，正向外引物F3和反向外引物B3。反应初始，FIP和F3先后与单链DNA模板结合，引发循环模板合成，随着F3的延伸，FIP产生的延伸链被置换出来，同时，其5'端发生自我碱基配对，形成环状结构。随即，BIP和B3以环状结构DNA作为模板延伸，引发新一轮链置换反应，最终形成一条哑铃状单链DNA，即循环模板。进入循环扩增阶段后，哑铃状单链DNA3'端以自身为模板进行延伸，打开5'端环状结构，形成一条双链茎环DNA。随后，FIP的F2区域与茎环DNA环状结构中的F2c区域互补配对，发生延伸置换反应，自此引发循环扩增和伸长再循环扩增，进入指数扩增阶段。随着FIP与BIP不断与环状结构结合，链置换反应持续发生，最终大量生成不同长度地多环花椰菜结构DNA。LAMP的主要优点是特异性强、扩增效率高。LAMP也存在一定的缺陷：由于反应需要的引物数量多浓度大，极易发生非特异性扩增，产生假阳性；靶序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种等温扩增核酸片段的方法，其特征在于：采用包括特异性引物对和通用引物对的引物组，补平所述特异性引物对与扩增模板结合后形成的切口，使所述通用引物对以补平产物为模板，在DNA聚合酶催化下等温扩增核酸模板。

【技术特征摘要】
1.一种等温扩增核酸片段的方法，其特征在于：采用包括特异性引物对和通用引物对的引物组，补平所述特异性引物对与扩增模板结合后形成的切口，使所述通用引物对以补平产物为模板，在DNA聚合酶催化下等温扩增核酸模板。2.根据权利要求1所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，所述特异性引物对由引物P1和P2组成，所述引物P1包括引物片段F1、F2、F3和F4，所述引物片段F1和F3反向互补，所述引物片段F4可与所述核酸模板互补；所述引物P2包括引物片段R1、R2、R3和R4，所述引物片段R1和R3反向互补，所述引物片段R4可与所述核酸模板互补。3.根据权利要求2所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，所述通用引物对由引物P3和P4组成，所述引物P3包括引物片段F3和F2c,所述引物片段F2c与所述引物片段F2反向互补，所述引物P4包括引物片段R3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王德国，王永真，宋春美，朱凯，孙军涛，张永清，张良，卢作焜，苏测洋，陈晨，
申请(专利权)人：许昌学院，
类型：发明
国别省市：河南,41