用于条形码化单个细胞或细胞群的核酸分子的方法和系统技术方案

本公开提供了用于通过对单个细胞或细胞群例如癌细胞和免疫系统细胞的内容物的分区分析来分析单个细胞或细胞群的方法、组合物和系统。可以将单个细胞或细胞群体可以与处理试剂共分区，所述处理试剂用于接近细胞内容物，并且用于唯一地识别给定细胞或细胞群的内容物，并且随后分析细胞的内容物并将其表征为来源于单个细胞或细胞群，包括通过测序进行的细胞的一或多种核酸的分析和表征。

Methods and systems for bar coding of nucleic acid molecules in a single cell or cell group

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于条形码化单个细胞或细胞群的核酸分子的方法和系统交叉引用本申请要求2016年10月19日提交的美国临时专利申请号62/410,326和2017年4月26日提交的美国临时专利申请号62/490,546的权益，其各自出于所有目的以全文引用的方式并入本文。
技术介绍
在分析和表征生物和生化物质和系统方面取得的重大进步已引起了在了解生命、健康、疾病和治疗机制方面的空前进步。在这些进步中，以生物系统的基因组构成为目标并进行表征的技术已经产生了一些最具开创性的结果，包括在基因扩增技术以及核酸测序技术的使用和开发方面的进步。核酸测序可用于获得各种生物医学方面的信息，包括诊断、预后、生物技术和法医生物学。测序可涉及包括克萨姆-吉尔伯特测序(Maxam-Gilbertsequencing)和链终止方法的方法；或包括鸟枪测序和桥式PCR的从头测序方法；或包括聚合酶克隆测序(polonysequencing)、454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序、IonTorrent半导体测序、HeliScope单分子测序、测序等的下一代方法。核酸测序技术(包括下一代DNA测序)已经用于细胞群的基因组和蛋白质组学分析。
技术实现思路
本文认识到需要用于分析单个细胞或小的细胞群的基因组和蛋白质组信息的方法、组合物和系统。此类细胞包括但不限于癌细胞、胎儿细胞和参与免疫应答的免疫细胞。本文提供了用于分析单个细胞或小的细胞群的方法、组合物和系统，包括分析这些单个细胞或细胞群的核酸并且将核酸归属到这些单个细胞或细胞群。在一个方面中，本公开提供了一种用于核酸测序的方法，其包括：(a)提供多个液滴，其中所述多个液滴中的液滴包含(i)包含核酸序列的核糖核酸(RNA)分子和(ii)包含与之偶联的核酸条形码分子的珠粒，其中所述核酸条形码分子包含条形码序列；(b)使用RNA分子和核酸条形码分子生成条形码化核酸分子，所述条形码化核酸分子从5'末端到3'末端包含对应于RNA分子的核酸序列的序列和条形码序列的补体；以及(c)对条形码化核酸分子或其衍生物进行测序。在一些实施方案中，RNA分子来自细胞。在一些实施方案中，液滴包括细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括在(b)之前从细胞释放RNA分子。在一些实施方案中，珠粒包含与之偶联的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子包括核酸条形码分子。在一些实施方案中，所述多个核酸分子中的每个核酸分子均包含条形码序列。在一些实施方案中，所述多个核酸分子中的每个核酸分子均包含在所述多个核酸分子之间有所不同的另外的条形码序列。在一些实施方案中，核酸条形码分子包含模板转换序列。在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之前，对条形码化核酸分子或其衍生物进行核酸扩增。在一些实施方案中，在从液滴释放条形码化核酸分子或其衍生物之后进行核酸扩增。在一些实施方案中，核酸扩增是聚合酶链反应。在一些实施方案中，RNA分子是信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中，在(a)中，液滴包含(i)包含另外的核酸序列的另外的核酸分子和(ii)包含另外的条形码序列的另外的核酸条形码分子，并且其中在(b)中，另外的核酸分子和另外的核酸条形码分子用于生成另外的条形码化核酸分子，所述另外的条形码化核酸分子从5'末端到3'末端包含另外的条形码序列和对应于另外的核酸序列的另外的序列。在一些实施方案中，另外的核酸条形码分子与珠粒偶联。在一些实施方案中，另外的核酸条形码分子与另外的珠粒偶联。在一些实施方案中，在液滴中进行(b)。在一些实施方案中，所述方法还包括从液滴释放条形码化核酸分子或其衍生物。在一些实施方案中，条形码化核酸分子还包含朝向3'末端的功能序列，其允许条形码化核酸分子或其衍生物与测序仪的流动池偶联。在一些实施方案中，序列是核酸序列的反向补体。在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之前，使用条形码化核酸分子或其衍生物和一对引物生成具有靶核酸序列的核酸子集。在一些实施方案中，靶核酸序列包含T细胞受体可变区序列、B细胞受体可变区序列或免疫球蛋白可变区序列。在一些实施方案中，引物对中的至少一个引物与T细胞受体核酸序列的恒定区、B细胞受体核酸序列的恒定区或免疫球蛋白核酸序列的恒定区杂交。在一些实施方案中，在(c)中对核酸子集或其衍生物进行测序。在一些实施方案中，所述方法还包括从珠粒释放核酸条形码分子。在一些实施方案中，在生成条形码化核酸分子之前，从珠粒释放核酸条形码分子。在一些实施方案中，在生成条形码化核酸分子的同时，从珠粒释放核酸条形码分子。在一些实施方案中，在生成条形码化核酸分子之后，从珠粒释放核酸条形码分子。在一些实施方案中，珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中，条形码序列是多个条形码区段的组合组装体(assembly)。在一些实施方案中，所述多个条形码区段包括至少三个区段。在一个方面中，本公开提供了一种用于生成标记的多核苷酸的方法。所述方法包括(a)在足以生成第一扩增产物的条件下对反应混合物进行第一扩增反应，其中反应混合物包含模板多核苷酸以及(i)具有与模板多核苷酸杂交的朝向3'末端的序列的引物和(ii)包含朝向5'末端的第一预定义序列的模板转换寡核苷酸；以及(b)在足以生成第二扩增产物的条件下、在条形码化寡核苷酸存在下对第一扩增产物进行第二扩增反应，其中条形码化寡核苷酸包含至少一段模板转换寡核苷酸的序列和至少第二预定义序列，其中(i)第二扩增反应使用第一扩增产物作为模板并且使用条形码化寡核苷酸作为引物，或者(ii)第二扩增反应使用条形码化寡核苷酸作为模板并且使用第一扩增产物的至少一部分作为引物，以生成第二扩增产物，其中第一扩增反应和第二扩增反应在相同的反应体积内进行。在一些实施方案中，第二扩增反应使用第一扩增产物作为模板并且使用条形码化寡核苷酸作为引物。在一些实施方案中，第二扩增反应使用条形码化寡核苷酸作为模板并且使用第一扩增产物的至少一部分作为引物。在一个方面中，本公开提供了一种用于生成标记的多核苷酸的方法，其包括(a)在反应体积中提供反应混合物，其中反应混合物包含(i)模板多核苷酸、(ii)包含与模板多核苷酸杂交的朝向引物3'末端的序列的引物和(iii)模板转换寡核苷酸；(b)在反应体积中，在足以生成包含引物、模板多核苷酸序列的反向补体和与模板转换寡核苷酸的至少一部分互补的序列的第一核酸产物的条件下对反应混合物进行第一反应；以及(c)在反应体积中对第一核酸产物进行第二反应，所述第二反应包括(i)使用第一核酸产物作为模板并且使用条形码化寡核苷酸作为引物，所述条形码化寡核苷酸包含至少一段模板转换寡核苷酸的序列，或者(ii)使用条形码化寡核苷酸作为模板并且使用第一核酸的至少一部分作为引物，以生成第二核酸产物。在一些实施方案中，模板多核苷酸获自单细胞。在一些实施方案中，单细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一扩增反应中生成第一扩增产物之前，在相同反应体积中裂解单细胞以获得模板多核苷酸。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含T细胞受体基因或基因产物。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含B细胞受体基因或基因产物。在一些实施方案中，模板多核苷酸是多个模板多核苷酸之一。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸测序的方法，其包括：(a)提供多个液滴，其中所述多个液滴中的液滴包含(i)包含核酸序列的核糖核酸(RNA)分子和(ii)包含与之偶联的核酸条形码分子的珠粒，其中所述核酸条形码分子包含条形码序列；(b)使用所述RNA分子和所述核酸条形码分子生成条形码化核酸分子，所述条形码化核酸分子从5'末端到3'末端包含对应于所述RNA分子的所述核酸序列的序列和所述条形码序列的补体；以及(c)对所述条形码化核酸分子或其衍生物进行测序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.19 US 62/410,326;2017.04.26 US 62/490,5461.一种用于核酸测序的方法，其包括：(a)提供多个液滴，其中所述多个液滴中的液滴包含(i)包含核酸序列的核糖核酸(RNA)分子和(ii)包含与之偶联的核酸条形码分子的珠粒，其中所述核酸条形码分子包含条形码序列；(b)使用所述RNA分子和所述核酸条形码分子生成条形码化核酸分子，所述条形码化核酸分子从5'末端到3'末端包含对应于所述RNA分子的所述核酸序列的序列和所述条形码序列的补体；以及(c)对所述条形码化核酸分子或其衍生物进行测序。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA分子来自细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述液滴包含所述细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其还步包括在(b)之前从所述细胞释放所述RNA分子。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述珠粒包含与之偶联的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子包含所述核酸条形码分子。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述多个核酸分子中的每个核酸分子均包含所述条形码序列。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述多个核酸分子中的每个核酸分子均包含在所述多个核酸分子之间有所不同的另外的条形码序列。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸条形码分子包含模板转换序列。9.根据权利要求1所述的方法，其还包括，在(c)之前，对所述条形码化核酸分子或其衍生物进行核酸扩增。10.根据权利要求9所述的方法，其中在从所述液滴释放所述条形码化核酸分子或其衍生物之后进行所述核酸扩增。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸扩增是聚合酶链反应。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA分子是信使核糖核酸(mRNA)分子。13.根据权利要求1所述的方法，其中在(a)中，所述液滴包含(i)包含另外的核酸序列的另外的核酸分子和(ii)包含另外的条形码序列的另外的核酸条形码分子，并且其中在(b)中，所述另外的核酸分子和所述另外的核酸条形码分子用于生成另外的条形码化核酸分子，所述另外的条形码化核酸分子从5'末端到3'末端包含所述另外的条形码序列和对应于所述另外的核酸序列的另外的序列。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述另外的核酸条形码分子与所述珠粒偶联。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述另外的核酸条形码分子与另外的珠粒偶联。16.根据权利要求1所述的方法，其中(b)在所述液滴中进行。17.根据权利要求16所述的方法，其还包括从所述液滴释放所述条形码化核酸分子或其衍生物。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述条形码化核酸分子还包含朝向3'末端的功能序列，其允许所述条形码化核酸分子或其衍生物与测序仪的流动池偶联。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述序列是所述核酸序列的反向补体。20.根据权利要求1所述的方法，其还包括，在(c)之前，使用所述条形码化核酸分子或其衍生物和一对引物生成具有靶核酸序列的核酸子集。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述靶核酸序列包含T细胞受体可变区序列、B细胞受体可变区序列或免疫球蛋白可变区序列。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述引物对中的至少一个引物与T细胞受体核酸序列的恒定区、B细胞受体核酸序列的恒定区或免疫球蛋白核酸序列的恒定区杂交。23.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸子集或其衍生物在(c)中被测序。24.根据权利要求1所述的方法，其还包括从所述珠粒释放所述核酸条形码分子。25.根据权利要求24所述的方法，其中在生成所述条形码化核酸分子之前，从所述珠粒释放所述核酸条形码分子。26.根据权利要求24所述的方法，其中在生成所述条形码化核酸分子的同时，从所述珠粒释放所述核酸条形码分子。27.根据权利要求24所述的方法，其中在生成所述条形码化核酸分子之后，从所述珠粒释放所述核酸条形码分子。28.根据权利要求1所述的方法，其中所述珠粒是凝胶珠粒。29.根据权利要求1所述的方法，其中所述条形码序列是多个条形码区段的组合组装体。30.根据权利要求29所述的方法，其中多个条形码区段包括至少三个区段。31.一种用于生成标记的多核苷酸的方法，其包括：(a)在反应体积中提供反应混合物，其中所述反应混合物包含(i)模板多核苷酸、(ii)包含与所述模板多核苷酸杂交的朝向引物3'末端的序列的所述引物和(iii)模板转换寡核苷酸；(b)在所述反应体积中，在足以生成包含所述引物、所述模板多核苷酸的序列的反向补体和与所述模板转换寡核苷酸的至少一部分互补的序列的第一核酸产物的条件下，对所述反应混合物进行第一反应；以及(c)在所述反应体积中对所述第一核酸产物进行第二反应，所述第二反应包括(i)使用所述第一核酸产物作为模板并且使用条形码化寡核苷酸作为引物，所述条形码化寡核苷酸包含至少一段所述模板转换寡核苷酸的序列，或(ii)使用所述条形码化寡核苷酸作为模板并且使用所述第一核酸产物的至少一部分作为引物，以生成第二核酸产物。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二反应包括使用所述第一核酸产物作为模板并且使用所述条形码化寡核苷酸作为引物。33.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二反应包括使用所述条形码化寡核苷酸作为模板并且使用所述第一核酸产物的至少一部分作为引物。34.根据权利要求31所述的方法，其中所述模板多核苷酸获自单细胞。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述单细胞是免疫细胞。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。37.根据权利要求35所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。38.根据权利要求34所述的方法，其还包括在所述第一反应中生成所述第一核酸产物之前，在所述反应体积中裂解所述单细胞以获得所述模板多核苷酸。39.根据权利要求31所述的方法，其中所述模板多核苷酸包含T细胞受体基因或基因产物。40.根据权利要求31所述的方法，其中所述模板多核苷酸包含B细胞受体基因或基因产物。41.根据权利要求31所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：塔尔耶伊·西格德·米克尔森，菲利普·贝尔格莱德，郑新颖，
申请(专利权)人：一零X基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US