一种基于干血片的痕量DNA提取方法技术

本发明专利技术专利涉及到一种基于干血片的痕量DNA提取方法，主要特征在于，在痕量DNA提取过程中制备高效液相分离管，并在DNA溶液收集后加100ng carrier RNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清。本发明专利技术专利具有上清液能够全部转移和操作简单的特征。

A Trace DNA Extraction Method Based on Dry Blood Tablets

【技术实现步骤摘要】
一种基于干血片的痕量DNA提取方法
本专利技术属于痕量DNA检测领域，特别涉及到一种基于干血片的痕量DNA提取方法。
技术介绍
痕量DNA是指含量低至皮克级别的DNA，在法医物证、刑事案件和微量生物上，灵敏、准确的DNA定量方法在生物学研究及应用领域中发挥着重要的作用，根据2005版《中国药典2005版(三部)》检测外源DNA含量采用的是Southernblotting杂交法，此法可以检出pg水平的DNA，但是半定量的方法。此外，也有相关研究人员建立了痕量DNA荧光检测方法，该方法抽提DNA起到了浓缩作用，样品中的DNA经过浓缩后可以达到荧光检出的水平。荧光法和Southernblotting杂交法比较，更快速、精度更高。然而，上述方法存在着上清液提取不完全和提取率不高以及DNA纯度不高等不足。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于干血片的痕量DNA提取方法。本专利技术技术方案如下：一种基于干血片的痕量DNA提取方法，主要是在痕量DNA提取过程中制备高效液相分离管，并在DNA溶液收集后加100ngcarrierRNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清。进一步的，所述提取方法步骤主要为以下所述：(1)取三片3×3mm的干血斑样品到1.5ml的离心管中。(2)加入20μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入240ul-300ul的裂解液。(3)涡旋震荡10sec-15sec混匀后，放入预热至50-60℃的恒温中过夜。(4)将过夜后液体连同滤纸转移至双层分离管，减少纸片上残留的DNA溶液，可回收98％以上的DNA溶液量。(5)制备高效液相分离管，向2ml离心管中加入聚二甲基硅氧烷+SiO2溶液200-300ul真空硅脂，混合均匀，并快速高速离心30秒-60秒。(6)DNA溶液收集后加100ngcarrierRNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清液；(7)加入1.3ml-1.5ml体积的无水乙醇，100ul3M醋酸钠PH5.2，最大转速4°离心60sec，弃上清；(8)再加75％-80％酒精洗涤一次最大转速4°离心60sec，弃上清。重复该步骤一次；(9)晾干后加入水溶解，获得初始DNA；(10)获得的初始DNA在通过BeckmanXPBeads纯化。进一步的，所述聚二甲基硅氧烷终浓度为10-50％)，所述SiO2溶液终浓度为1-10％。进一步的，所述恒温方式为水浴恒温、沙浴或者金属浴；进一步的，所述carrierRNA作为酵母tRNA溶液，用作核酸纯化和沉淀过程中的载体。更进一步的，所述提取方法得到高纯度的DNA，纯度可达到260/280＝1.8-2.1之间。与现有技术对比，本专利技术方法提供了在上清液转移过程中，传统方法是在普通离心管内加酚氯仿离心分层后吸取上清，回收上清不彻底，上清液能够全部转移，并且在分离的过程中增加了100ngcarrierRNA混合，实现了提取率大幅增加，精密度较高，同时，本方法在提高精度的时，并没有增加原始方法的设备。附图说明图1本专利技术提供的一种基于干血片的痕量DNA提取方法主要步骤；图2本专利技术中增加carriedRNA的高效液相分离管和制备流程；图3本专利技术专利实施例结构对比图；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细、完整的说明。实施例：根据图1和图2的所示流程，接下来主要使用传统方法与本专利技术专利的专利技术进行对比操作，主要介绍新方法的操作步骤，如下所示：传统方法步骤如下：l.样品加入等体积和酚或酚/氯仿(1：1)混合液.2.上下颠倒很匀.3.室温，12000转/分钟，离心5分钟.如蛋白质较多或分界不清时，可离心10分钟。4.吸取上层(水层)移置另一新的离心管中.5.加入等体积酚/氯仿/异戊酸(25：24：1)溶液.重复步骤2、3、4.6.加入等体积氯仿/异戊酸(24：1)溶液.重复步骤2、3、4。7.乙醇沉淀核酸(见核酸的沉淀纯化).本专利技术专利方法步骤：1.取三片3×3mm的干血斑样品到1.5ml的离心管(自备)中(101)。2.加入20μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入240ul-300ul的裂解液(102)。3.涡旋震荡10sec-15sec混匀后，放入预热至50-60℃的恒温(金属浴，水浴，沙浴)中过夜(103)。4.将过夜后液体连同滤纸转移至双层分离管，减少纸片上残留的DNA溶液，可回收98％以上的DNA溶液量(104)。5.制备高效液相分离管(105)：向2ml离心管中加入聚二甲基硅氧烷(终浓度10-50％)+SiO2溶液(终浓度1-10％)+200-300ul真空硅脂(201)，混合均匀(202)，并快速高速离心30秒-60秒(203)。6.DNA溶液收集后加100ngcarrierRNA(106)(酵母tRNA溶液，用作核酸纯化和沉淀过程中的载体)混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清(传统方法是在普通离心管内加酚氯仿离心分层后吸取上清，回收上清不彻底)；7.加入1.3ml-1.5ml体积的无水乙醇，100ul3M醋酸钠PH5.2，最大转速4°离心60sec，弃上清(107)。8.再加75％-80％酒精洗涤一次最大转速4°离心60sec，弃上清。重复该步骤一次(108)。9.晾干后加入水溶解，获得初始DNA(109)。获得的初始DNA在通过BeckmanXPBeads纯化，得到高纯度的DNA，纯度可达到260/280＝1.8-2.1之间。通过以上两种方法的对比，得出了如图3所示。上述实验结果充分说明本方法的创新性，大大超越了传统方法。最后，有必要说明一下，上述实施例，只是针对本专利技术技术方案作进一步详细说明，不能够理解为本专利技术的保护范围，本领域的技术人员根据本专利技术的上述内容作出的一些非本质改变和调整均属于本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于干血片的痕量DNA提取方法，主要特征在于，在痕量DNA提取过程中制备高效液相分离管，并在DNA溶液收集后加100ng carrier RNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清。

【技术特征摘要】
1.一种基于干血片的痕量DNA提取方法，主要特征在于，在痕量DNA提取过程中制备高效液相分离管，并在DNA溶液收集后加100ngcarrierRNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，回收98％上清。2.根据权利要求1所述的一种基于干血片的痕量DNA提取方法，主要特征在于，所述提取方法步骤主要为以下所述：(1)取三片3×3mm的干血斑样品到1.5ml的离心管中。(2)加入20μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入240ul-300ul的裂解液。(3)涡旋震荡10sec-15sec混匀后，放入预热至50-60℃的恒温中过夜。(4)将过夜后液体连同滤纸转移至双层分离管，减少纸片上残留的DNA溶液，可回收98％以上的DNA溶液量。(5)制备高效液相分离管，向2ml离心管中加入聚二甲基硅氧烷+SiO2溶液200-300ul真空硅脂，混合均匀，并快速高速离心30秒-60秒。(6)DNA溶液收集后加100ngcarrierRNA混合，加入等体积酚氯仿，并转移到高效液相分离管，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何元林，玥江，戴俊程，
申请(专利权)人：南京亿科人群健康研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32