一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法技术

本发明专利技术公开一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，涉及生物工程纯化技术领域。该方法包括16％预制胶配制、10xTBE缓冲液配制、PAGE胶配制、加样跑样四个步骤，上样前加饱和尿素溶解引物，一方面可以使样品变性，另一方面可以增加样品比重，使得样品加入凹槽时使引物下沉，与分离方法配套的凝胶电泳槽包括低温恒温箱、电泳槽主体，电泳槽主体放置于低温恒温箱的内部，低温恒温箱内设有冷凝器、第二温度传感器并盛装有乙醇，通过冷却乙醇的循环冷却，能够保持电泳缓冲液的低温恒温，不会造成由于温度升高而使条带变形的情况，大大节约了需要更换缓冲液的控温成本。

Purification and Separation of Large Scale Primer Condensation Electrophoresis

【技术实现步骤摘要】
一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法
本专利技术涉及生物工程纯化
，具体涉及一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法。
技术介绍
目前，针对寡核苷酸引物的纯化，聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE，PolyacrylamideGelElectrophcresis)是一种应用较为广泛的方法，该方法是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，通过对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法，常用于分离蛋白质和寡核苷酸。作用原理是凭借聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。PAGE纯化基于尺寸和象分离全长产物和失败序列，可以分离120碱基以内相差一个碱基的引物，从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90％，相比与其他纯化方法，PAGE纯化对大于50mer的长链01igoDNA的纯化特别有效，制品纯度能够达到90～95％。PAGE纯化虽然纯化效果较好，而且可以直观的看到DNA合成片段的质控环节，但是PAGE纯化实验步骤多、费人力、电泳及后处理过程样品损失量大以及电泳时间长，纯化时间长达6-8小时，这样不利于大规模的DNA引物纯化。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，包括16％预制胶配制、10xTBE缓冲液配制、PAGE胶配制、加样跑样四个步骤，上样前加饱和尿素溶解引物，一方面可以使样品变性，另一方面可以增加样品比重，使得样品加入凹槽时使引物下沉，与分离方法配套的凝胶电泳槽能够保持低温恒温，不会造成由于温度升高而使条带变形的情况。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，包括以下步骤：1)16％预制胶配制：将4200g尿素、1520g丙烯酰胺、80g甲叉双丙烯酰胺、1L10xTBE缓冲液混合后，使用超纯水定容至10L；2)10xTBE缓冲液配制：将108g三羟甲基氨基甲烷、55g硼酸、7.44g乙二胺四乙酸二钠，加入超纯水用磁力搅拌器搅拌溶解，最后用超纯水定容至1L；3)PAGE胶配制：先将胶板用夹子和橡皮条夹好，用量筒量取500mL/400mL的16％预制胶，倒入500mL蓝盖瓶，然后迅速加入1.5mL/1.2mL的10％过硫酸铵溶液和0.5mL/0.4mL的四甲基乙二胺，充分震荡静止几秒，待气泡排出时倒入胶板，倒完后插上梳子等待胶凝固；当胶板上摸起来发热时则胶开始逐渐凝固形成凝胶层；凝固之后缓慢将梳子用钢尺拔出来，再将梳子插入后产生的两个凹槽残胶给捣出来，并用水冲洗干净；将板子底部的条子抽走，胶板擦干净后放入凝胶电泳槽，用夹子夹紧，在上面倒入1xTBE缓冲液淹没凹槽上方；4)加样跑样：上样前把样品抽干后，加入适量饱和尿素溶解，用移液枪吸入后，缓慢打进凹槽；有修饰的外面用袋子罩好避光，窗帘拉好；无修饰的要做标记；然后打开电源、单向阀、冷却器、冷凝器，乙醇循环箱内的乙醇经过冷却器、单向阀、螺旋盘管进入低温恒温箱内，在电压600V条件下样品跑样6-8h即可。作为本专利技术进一步的方案，12bp及以下的DNA使用20％的预制胶，12-60bp的DNA使用16％的预制胶，60bp以上的DNA使用12％的预制胶。作为本专利技术进一步的方案，所述凹槽的上样量不超过150OD。作为本专利技术进一步的方案，所述凝胶电泳槽包括低温恒温箱、电泳槽主体，电泳槽主体放置于低温恒温箱的内部，低温恒温箱内设有冷凝器、第二温度传感器并盛装有乙醇；电泳槽主体包括上电泳池、下电泳池、电源，上电泳池与下电泳池内均盛装有电泳缓冲液，电源的正极导线延伸入下电泳池的电泳缓冲液中，电源的负极导线延伸入上电泳池的电泳缓冲液中；上电泳池与下电泳池之间设有两块长方形的胶板，两块胶板之间容置有凝胶层，凝胶层的顶部设有用于添加样品的凹槽；所述低温恒温箱的内壁与外壁之间设有螺旋盘管，螺旋盘管的一端通过管道与第一流量计连接，另一侧通过管道与第二流量计连接，第一流量计与第二流量计在低温恒温箱的外部连接管路上设有单向阀、冷却器、乙醇循环箱。作为本专利技术进一步的方案，所述低温恒温箱外壁与内壁之间设有蓄冷保温层，内壁纵截面的四个边角处均设有冷却液错流机构，冷却液错流机构包括防水电机、联轴器、搅拌叶轮，防水电机、联轴器、搅拌叶轮依次同轴连接且轴线均延伸至内壁纵截面的中心点处。通过防水电机带动联轴器转动，联轴器进一步带动搅拌叶轮转动，在低温恒温箱的内部可以促进乙醇的错流循环，结合冷凝器的冷凝作用，一方面可以促进内部乙醇的降温，另一方面促进乙醇与上电泳池与下电泳池内电泳缓冲液的冷交换，保持电泳缓冲液低于常温25℃的状态。作为本专利技术进一步的方案，所述冷却器内设有PLC控制器、第一温度传感器，PLC控制器与冷却器、冷凝器、第一温度传感器、第二温度传感器均信号连接。作为本专利技术进一步的方案，所述第一温度传感器、第二温度传感器检测到的温度有一个达到13-16℃时，PLC控制器控制冷却器、冷凝器关闭；当第一温度传感器、第二温度传感器检测到的温度高于16℃时，PLC控制器控制冷却器、冷凝器开启。本专利技术的凝胶电泳槽，使用移液枪向凹槽内注入样品后，开启电源，电源的正负极分别通过正极导线、负极导线与电泳缓冲液形成回路，发生引物的电泳纯化分离。然后开启冷凝器、冷却器，冷凝器、冷却器分别对低温恒温箱和乙醇循环箱内的乙醇进行降温，冷却器冷却后的乙醇经单向阀、第一流量计进入低温恒温箱的内壁与外壁之间，同时乙醇还可沿第二流量计进入乙醇循环箱中，形成乙醇循环回路，在低温恒温箱与电泳槽主体的冷交换中，可以保持电泳缓冲液处于13-16℃的低温恒温状态。本专利技术的有益效果：1、本专利技术在电泳时通过增加冷凝装置，能保持恒温，不会造成由于温度升高而使条带变形的情况；胶板更宽更长，上样量可以更大，分离度更好，可以分开相差一个碱基的引物；上样前加饱和尿素溶解引物，一方面可以使样品变性，另一方面可以增加样品比重，使得样品加入凹槽时使引物下沉，否则会上浮。2、本专利技术的引物纯化在每次电泳完可用注射器将上面缓冲液吸取保存下来再利用，不然取下板后缓冲液会流到下面槽，不仅要处理，同时下面槽的缓冲液不干净，该做法既能节省试剂，又可以节约时间。3、本专利技术的凝胶电泳槽，冷凝器、冷却器分别对低温恒温箱和乙醇循环箱内的乙醇进行降温，冷却器冷却后的乙醇经单向阀、第一流量计进入低温恒温箱的内壁与外壁之间，同时乙醇还可沿第二流量计进入乙醇循环箱中，形成乙醇循环回路，在低温恒温箱与电泳槽主体的冷交换中，可以保持电泳缓冲液处于13-16℃的低温恒温状态，实现全自动的低温控温，大大节约了需要更换缓冲液的控温成本。4、本专利技术通过防水电机带动联轴器转动，联轴器进一步带动搅拌叶轮转动，在低温恒温箱的内部可以促进乙醇的错流循环，结合冷凝器的冷凝作用，一方面可以促进内部乙醇的降温，另一方面促进乙醇与上电泳池与下电泳池内电泳缓冲液的冷交换，保持电泳缓冲液低于常温25℃的状态。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)16％预制胶配制：将4200g尿素、1520g丙烯酰胺、80g甲叉双丙烯酰胺、1L 10xTBE缓冲液混合后，使用超纯水定容至10L；2)10xTBE缓冲液配制：将108g三羟甲基氨基甲烷、55g硼酸、7.44g乙二胺四乙酸二钠，加入超纯水用磁力搅拌器搅拌溶解，最后用超纯水定容至1L；3)PAGE胶配制：先将胶板(26)用夹子和橡皮条夹好，用量筒量取500mL/400mL的16％预制胶，倒入500mL蓝盖瓶，然后迅速加入1.5mL/1.2mL的10％过硫酸铵溶液和0.5mL/0.4mL的四甲基乙二胺，充分震荡静止几秒，待气泡排出时倒入胶板，倒完后插上梳子等待胶凝固；当胶板上摸起来发热时则胶开始逐渐凝固形成凝胶层(27)；凝固之后缓慢将梳子用钢尺拔出来，再将梳子插入后产生的两个凹槽残胶给捣出来，并用水冲洗干净；将板子底部的条子抽走，胶板(26)擦干净后放入凝胶电泳槽，用夹子夹紧，在上面倒入1xTBE缓冲液淹没凹槽(28)上方；4)加样跑样：上样前把样品抽干后，加入适量饱和尿素溶解，用移液枪吸入后，缓慢打进凹槽(28)；有修饰的外面用袋子罩好避光，窗帘拉好；无修饰的要做标记；然后打开电源(23)、单向阀(5)、冷却器(6)、冷凝器(11)，乙醇循环箱(7)内的乙醇经过冷却器(6)、单向阀(5)、螺旋盘管(10)进入低温恒温箱内，在电压600V条件下样品跑样6‑8h即可。...

【技术特征摘要】
1.一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)16％预制胶配制：将4200g尿素、1520g丙烯酰胺、80g甲叉双丙烯酰胺、1L10xTBE缓冲液混合后，使用超纯水定容至10L；2)10xTBE缓冲液配制：将108g三羟甲基氨基甲烷、55g硼酸、7.44g乙二胺四乙酸二钠，加入超纯水用磁力搅拌器搅拌溶解，最后用超纯水定容至1L；3)PAGE胶配制：先将胶板(26)用夹子和橡皮条夹好，用量筒量取500mL/400mL的16％预制胶，倒入500mL蓝盖瓶，然后迅速加入1.5mL/1.2mL的10％过硫酸铵溶液和0.5mL/0.4mL的四甲基乙二胺，充分震荡静止几秒，待气泡排出时倒入胶板，倒完后插上梳子等待胶凝固；当胶板上摸起来发热时则胶开始逐渐凝固形成凝胶层(27)；凝固之后缓慢将梳子用钢尺拔出来，再将梳子插入后产生的两个凹槽残胶给捣出来，并用水冲洗干净；将板子底部的条子抽走，胶板(26)擦干净后放入凝胶电泳槽，用夹子夹紧，在上面倒入1xTBE缓冲液淹没凹槽(28)上方；4)加样跑样：上样前把样品抽干后，加入适量饱和尿素溶解，用移液枪吸入后，缓慢打进凹槽(28)；有修饰的外面用袋子罩好避光，窗帘拉好；无修饰的要做标记；然后打开电源(23)、单向阀(5)、冷却器(6)、冷凝器(11)，乙醇循环箱(7)内的乙醇经过冷却器(6)、单向阀(5)、螺旋盘管(10)进入低温恒温箱内，在电压600V条件下样品跑样6-8h即可。2.根据权利要求1所述的大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，其特征在于，12bp及以下的DNA使用20％的预制胶，12-60bp的DNA使用16％的预制胶，60bp以上的DNA使用12％的预制胶。3.根据权利要求1所述的大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，其特征在于，所述凹槽的上样量不超过150OD。4.根据权利要求1所述的大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，其特征在于，所述凝胶电泳槽包括低温恒温箱(1)、电泳槽主体(2)，电泳槽主体(2)放置于低温恒温箱(1)的内...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，占应强，刘宗文，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34