基因沉默的改善或与基因沉默有关的改善制造技术

本发明专利技术提供了将多核苷酸递送至地下植物有害生物的方法。具体而言，本发明专利技术涉及通过用猝灭剂基本上猝灭带正电荷的残基来降低组合物与土壤结合的方法，所述组合物包含多核苷酸和阳离子聚合物。本发明专利技术还包括含有阳离子聚合物、多核苷酸和猝灭剂的组合物。

Improvement of gene silencing or improvements associated with gene silencing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因沉默的改善或与基因沉默有关的改善本专利技术涉及通过双链RNA控制基因表达。具体而言，本专利技术涉及增强外源性-即在靶生物体外部并且在相对苛刻的环境条件下-施用的双链RNA以沉默该生物体中的基因表达的方法。本专利技术还涉及用于所述方法的组合物，以及已知试剂在所述方法中的用途，所述试剂“猝灭”包含多核苷酸(特别是dsRNA)和阳离子聚合物的络合物中的正电荷。潜在沉默基因表达的RNA干扰现象是熟知的。RNA相对不稳定并且可以通过例如普遍存在于甚至细胞外的核糖核酸酶迅速降解。将dsRNA直接应用于靶生物体，抑或经由外源性施用至靶生物体存在的场所的问题在于RNA的稳定性差。外源性应用意指以生物体可将其并入其中的方式施用于靶生物体，或者dsRNA在与靶生物体不同的第一生物体中产生并且靶生物体并入第一生物体或其包含dsRNA的部分，使得-无论哪种方式-所述dsRNA能够实现包含对应于由dsRNA包含的核苷酸序列的核苷酸序列的基因的转录后沉默。外源性应用与内源性产生(所述内源性产生是指能够在转录后沉默靶向基因的双链RNA的靶生物体的细胞中产生(通常经由从适当的异源序列表达))不同。尽管外源施用的dsRNA通常能够在短期内、可能甚至在施用后多至几天内施加相关的生物效应，但所述效应通常迅速下降，因为dsRNA在例如土壤中典型地具有小于约12小时至24小时的半衰期，并且还要进一步取决于其施用的精确环境条件。已经提出了对这个问题的不同解决方案，包括通过封装或以其他的方式将其结合到增强其稳定性的聚合物上来稳定dsRNA，从而提供增加的作用持续时间。然而，这种稳定的dsRNA并非没有其自身的问题，因为它与阳离子聚合物形成的络合物可以通过存在于或处于如下场所的带电荷的粒子结合或以其他方式与所述带电荷的粒子结合，所述场所降低其可用性或阻碍络合物穿过所述场所的运动，并且典型地阻碍朝向靶生物体所在位点的运动。靶生物体远离最初施用dsRNA的位点的运动加剧了这个问题。因此，本专利技术涉及以下问题的解决方案：一方面稳定dsRNA以使其足以能够发挥所希望的生物效应，以及另一方面使得由此稳定的dsRNA保持可用或在靶生物体所在的场所处或场所内移动或被移动。根据本专利技术，提供了抑制或基本上降低组合物(所述组合物包含阳离子聚合物和多核苷酸形成的络合物)与存在于土壤中的带负电荷分子结合的方法，所述方法包括将能够基本上中和络合物上的正电荷的猝灭剂包含于所述组合物中。在本专利技术的组合物的特别优选的实施例中，多核苷酸是dsRNA，聚合物是多胺，并且猝灭剂是单醛或单环氧化物。在本专利技术的特别优选的实施例中，聚合物是直链或支链的聚乙烯亚胺、多肽或阳离子多糖。在本专利技术的特别优选的实施例中，聚合物是直链或支链的聚乙烯亚胺。在本专利技术的特别优选的实施例中，带负电荷的粒子包含腐殖酸。本专利技术还提供了控制地下植物有害生物侵袭的方法，所述方法包括提供：a)包含阳离子聚合物和dsRNA形成的络合物的组合物，b)用猝灭剂基本上中和a)的络合物的表面暴露的正电荷，以及c)将b)的组合物施用于土壤，其中dsRNA在所述地下植物有害生物中实现靶基因的转录后沉默。地下植物有害生物包括在其生命周期的至少一部分(例如幼虫阶段)中驻留于土壤的那些有害生物。地下有害生物包括来自由以下组成的组中的那些：西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、南美叶甲(葫芦甲虫(cucurbitbeetle))、线虫、金针虫和蛴螬、以及适当的土壤病原体，如细菌和真菌。优选地，地下有害生物是根萤叶甲属物种。本专利技术还提供了猝灭剂用于基本上中和络合物中残留的带正电荷的基团的用途，所述络合物包含多核苷酸和阳离子聚合物。本专利技术还提供了组合物，所述组合物包含阳离子聚合物和多核苷酸形成的络合物、以及能够基本上中和所述络合物上残留的表面暴露的带正电荷的基团的猝灭剂，其中所述聚合物选自由以下组成的组：支链或直链的聚乙烯亚胺，含咪唑的聚合物，壳聚糖，阳离子多糖，聚酰胺基胺，包含胺基团的氨基酸(如赖氨酸、组氨酸和精氨酸)的聚合物和共聚物，以及多胺。在本专利技术的特别优选的实施例中，存在于组合物中的阳离子聚合物是支链或直链的聚乙烯亚胺。络合物意指通过涉及两个或更多个组分分子实体(离子的或不带电荷的)的松散缔合而形成的分子实体。当阳离子聚合物和多核苷酸形成络合物时，多核苷酸上的净负电荷可能不足以抵消或“中和”阳离子聚合物上所有表面暴露的带正电荷的基团，结果是所述络合物包含残留的表面暴露的带正电荷的基团。本专利技术的多核苷酸可以是RNA。RNA可以是dsRNA，但它也可以是siRNA、miRNA或能够进行RNAi基因沉默的任何其他RNA分子。优选地，多核苷酸是dsRNA。优选地，dsRNA包含至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个与靶生物体中靶基因一致或互补的核苷酸。适合的靶基因是其中转录后沉默对靶生物体具有不利影响的那些。例如，改变生长、发育迟缓、死亡率增加、生殖能力下降或繁殖力下降、摄食行为或运动减少或停止、或变态阶段发展减少或停止。阳离子聚合物可以选自由以下组成的组：支链或直链的聚乙烯亚胺、含咪唑的聚合物、壳聚糖、阳离子多糖、聚酰胺基胺、和包含叔胺基团的氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)的聚合物。可替代地，阳离子聚合物可以是多胺、或包含至少5个胺基团的支链多胺。在多核苷酸是dsRNA的情况下，简单的多胺(如精胺、亚精胺、腐胺和尸胺)不是特别优选的，因为使用猝灭剂来中和这种简单的多胺和dsRNA形成的络合物上的任何残留电荷可以使所述络合物解离。在组合物的优选的实施例中，络合物包含于细胞裂解物中或在完整细胞内形成，并将所述猝灭剂添加至所述络合物中。就猝灭剂而言-含有能够与胺反应以猝灭其上正电荷的单个基团的任何物质都是能胜任的，尽管一些试剂是优选的，包括异氰酸酯、单环氧化物、单酯、单羧酸、单酸酐、单醛和焦碳酸酯。但是，特别优选的猝灭剂是单醛或单环氧化物。单醛可以是水溶性的或水不溶性的。存在于本专利技术的组合物中的水溶性单醛包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛和己醛。优选的水不溶性单醛包括庚醛、辛醛和癸醛。优选的单环氧化物包括聚合度在从1至约10范围内的聚乙二醇缩水甘油醚。猝灭剂应以如下量存在于组合物中，所述量应足以基本上猝灭络合物中任何残留的表面暴露的带正电荷的基团，使得所述络合物基本上不与带负电荷的粒子(如存在于土壤中的带负电荷的粒子)结合，其中腐殖酸就是一个实例。熟练的配方化学师有能力容易地确定这些量是多少，但典型地它们在组合物中以如下量存在，所述量使得单价猝灭剂的摩尔数等于络合物中存在的胺摩尔数的从约10％至约190％(认识到对于猝灭反应，伯胺是二价的，而仲胺是单价的)。在多核苷酸是dsRNA的情况下，所述dsRNA包含与真核细胞中基因的mRNA的序列基本上一致的序列。具体而言，真核生物可以是选自由以下组成的组中的昆虫：西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制或基本上降低组合物与存在于土壤中的带负电荷的分子结合的方法，所述组合物包含阳离子聚合物和多核苷酸形成的络合物，所述方法包括将能够基本上中和所述络合物上的表面暴露的正电荷的猝灭剂包含于所述组合物中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.05 US 62/404,2451.一种抑制或基本上降低组合物与存在于土壤中的带负电荷的分子结合的方法，所述组合物包含阳离子聚合物和多核苷酸形成的络合物，所述方法包括将能够基本上中和所述络合物上的表面暴露的正电荷的猝灭剂包含于所述组合物中。2.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述多核苷酸是dsRNA，所述聚合物是多胺，并且所述猝灭剂是单醛。3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述聚合物是直链或支链的聚乙烯亚胺、多肽或阳离子多糖。4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述带负电荷的粒子包含腐殖酸。5.一种控制地下植物有害生物侵袭的方法，所述方法包括提供；a)包含阳离子聚合物和dsRNA形成的络合物的组合物，b)用猝灭剂基本上中和a)所述的络合物的表面暴露的正电荷，以及c)将b)的组合物施用于土壤，其中所述dsRNA在所述地下植物有害生物中实现靶基因的转录后沉默。6.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述地下植物有害生物选自由以下组成的组：西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、南美叶甲(葫芦甲虫)、线虫、金针虫和蛴螬、以及适当的土壤病原体，如细菌和真菌。7.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述地下植物有害生物是根萤叶甲属昆虫。8.猝灭剂用于基本上中和络合物中残留的带正电荷的基团的用途，所述络合物包含多核苷酸和阳离子聚合物。9.一种组合物，所述组合物包含阳离子聚合物和多核苷酸形成的络合物、以及能够基本上中和所述络合物上残留的表面暴露的带正电荷的基团的猝灭剂，其中所述聚合物选自由以下组成的组：支链或直链的聚乙烯亚胺，含咪唑的聚合物，壳聚糖，阳离子多糖，聚酰胺基胺，包含胺基团的氨基酸如赖氨酸、组氨酸和精氨酸的聚合物和共聚物，以及多胺，其中表面暴露的带正电荷的基团将以另外的方式导致土壤吸附所述络合物。10.根据权利要求9所...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·福勒，N·D·朱瑞，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH