一种引物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于食管鳞癌检测技术领域，涉及一种引物、试剂盒及其应用。其中，所述引物特异性地扩增lncRNA PANDA，所述lncRNA PANDA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术提供的引物能够作为食管鳞癌的分子标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种引物、试剂盒及其应用
本专利技术属于食管鳞癌检测
，更具体地，涉及一种引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
食管癌是严重威胁人类健康的最常见恶性肿瘤之一，主要有两种病理分型：鳞癌和腺癌。在我国90％食管癌是鳞癌，其分布具有明显的地域差异。我国食管鳞癌发病率占全世界食管鳞癌发病率的70％以上，并且预后较差，术后5年总体生存率较低。食管癌预后较差与发现患病较晚有关，并且与肿瘤转移有着密切的关联。因此，寻找可靠的生物标志物作为早期诊断依据和可靠的治疗靶点，提高食管癌患者的生存率具有重要的理论意义和实践指导价值。长链非编码RNA(longnon-codingRNAs，lncRNAs)是一类转录本长度大于200bp的RNA，其本身并不编码蛋白。lncRNAs的数量远远大于蛋白编码基因的数量，并且lncRNAs的表达具有组织特异性。目前的研究成果已证实lncRNAs与人类肿瘤密切相关，其在功能和结构方面的多样性已被初步研究阐释，并因其在癌症发生发展中的独特功能成为肿瘤研究的新热点。研究者已经在多种肿瘤中深入探讨和研究lncRNAs参与肿瘤的发生发展的功能和机制，然而lncRNAs在食管癌发生发展中的相关性研究，鲜有报道，关于lncRNAs在食管癌中的分子调控机制还有许多问题没有研究不清楚。结构不同的lncRNAs表现出组织特异性，遵从不同的分子调控机制，导致不同的分子调控结果。根据lncRNAs的不同功能和分子调控机制，挖掘其分子结构的共性与差异性，进一步阐述其功能的多样性和复杂性，将为食管癌的研究开辟新的思路，有助于提高食管癌的诊疗水平。然而，在食管鳞癌中，尽管lncRNAs在食管鳞癌的研究有一些报道，但其作为分子标志物还鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种引物、试剂盒及其应用，能够对lncRNAPANDA进行特异性扩增，作为食管鳞癌的分子标志物。为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种引物，所述引物特异性地扩增lncRNAPANDA，所述lncRNAPANDA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术的第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。具体地，所述试剂盒还包括：SYBRPremixExTaqTMII；ROCReferenceDye/II；cDNA；以及无菌水。更具体地，所述SYBRPremixExTaqTMII为10μl；所述ROCReferenceDye/II为0.4μl；所述cDNA为1μl；所述上游引物的浓度为10μM，所述上游引物的加入体积为0.4μl；所述下游引物的浓度为10μM，所述下游引物的加入体积为0.4μl；所述无菌水为7.8μl。本专利技术的第三方面提供上述的引物在制备检测和/或诊断食管鳞癌的药物中的应用。本专利技术的第四方面提供上述的试剂盒在制备检测和/或诊断食管鳞癌的药物中的应用。本专利技术提供的引物能够特异性地扩增lncRNAPANDA，从而能够作为食管鳞癌的分子标志物。本专利技术提供的试剂盒能够特异性地扩增lncRNAPANDA。本专利技术提供的引物和试剂盒均可在制备检测和/或诊断食管鳞癌的药物中的应用。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本专利技术示例性实施方式进行更详细的描述，本专利技术的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本专利技术示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。图1示出了lncRNAPANDA所在的染色体上的位置的示意图。图2示出了lncRNAPANDA在134例食管鳞癌患者的癌与癌旁正常组织中的表达量的示意图。图3示出了lncRNAPANDA在食管鳞癌患者中的表达水平与患者生存率的相关性的示意图。具体实施方式下面将更详细地描述本专利技术的优选实施方式。虽然以下描述了本专利技术的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例11.病例选择收集南京医科大学第三临床医学院(附属南京医院)肿瘤外科2001年至2012年食管鳞癌手术患者的临床组织样本。选取134例食管鳞癌组织样本及相应的癌旁(距肿瘤边缘5CM以上的正常食管粘膜组织)组织样本。患者术前均未进行过放化疗，所有的组织样本离体后立刻投入液氮中，后移入–80℃超低温冰箱长期储存以备用。其中76例的组织样本有5年以上随访资料。本实验所有标本均获得患者或其委托人签署知情同意，所有涉及人体标本的研究均获得南京市第一医院伦理委员会批准。研究患者纳入标准如下：a.经术后病理学证实为食管鳞癌(按照第7版(2009年)TNM分期标准进行临床分期)；b.住院期间接受根治或姑息性切除的患者，同时排除术前放化疗者；c.现病史、家族史、个人史以及各种检查资料均完善。本研究中食管鳞癌患者癌和癌旁组织134例。临床资料的收集主要分为患者的姓名、性别、年龄、职业、既往病史、家族史、女性月经史以及婚育史等。除上述一般资料外，还包括临床特征，包括肿瘤的组织学类型、部位、大小、浸润程度、淋巴结有无转移，肿瘤细胞分化程度，肿瘤TNM分期(T是原发灶，N是淋巴结，M是远处转移)，手术时间，术前有无放化疗以及常规辅助检查等资料。同时获得所有人的随访同意，检查结果资料完善保存。2.标本收集组织样本在离体后立刻用冰冻生理盐水冲洗，后迅速放入准备好的冻存管中，冻存管在取样前事先已用记号笔进行编号，且管内加有RNA保护液。将盖紧的冻存管迅速冷冻在液氮中。从液氮罐中取出样本后，迅速去除组织表面RNA保护液，将组织块放入已预冷过的研钵中进行充分研磨，边研磨边加液氮，以防止组织样本中的RNA降解，整个过程避免液氮挥发殆尽。将组织样本研磨成粉末后(3-5min)，给每个研钵中加入1-2mlTrizol，将粉末和Trizol继续充分研磨混匀，然后将混合物转移至1.5mlEP管中。实施例21.对上述134例患者的食管鳞癌组织样本及相应的癌旁组织样本进行总RNA提取。其中每个组织样本操作如下：1)取0.1g冻存的组织样本，液氮研磨充分(成粉末状)或1×107～5×107细胞(弃培养基)，预冷的PBS润洗2次。2)加入1ml的Trizol裂解液，以无菌无酶枪头吹打混匀，静置5min后，将裂解液移入预先做好标记的1.5ml的EP管中。3)4℃，7500g，离心5min，取上清加入相当于Trizol体积1/5的氯仿，震荡混匀30s，静置2min。4)4℃，12000g，离心15min。5)溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物)，转移水相层至新标记的1.5mlEP管中，尽量避免吸到白色沉淀物。6)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置10min。7)4℃，12000g，离心10min。(等待时间现配75％的乙醇)。8)弃上清，加入1ml75％的乙醇，洗涤RNA沉淀。9)4℃，7500g，离心5min，弃上清。10)尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。11)用DEPC水10-40μl(具体量依据沉淀的大小)溶解RNA沉淀。2.对获得的每个组织样本的RNA的浓度及完整性进行测定。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物，其特征在于，所述引物特异性地扩增lncRNA PANDA，所述lncRNA PANDA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于，所述引物特异性地扩增lncRNAPANDA，所述lncRNAPANDA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：SYBRPremixExTaqTMII；ROCReferenceDye/II；cDNA；以及无...

【专利技术属性】
技术研发人员：史卫红，卞勇华，曹秀峰，
申请(专利权)人：江苏医药职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32