一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物制造技术

本发明专利技术涉及一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物、试剂盒以及在单核苷酸多态性检测中的应用。所述发夹修饰引物包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列。本发明专利技术提供的发夹修饰引物价格低廉且特异性高，运用通用的荧光引物大大降低成本，所需要的其他实验耗材也廉价易得；一次PCR后进行毛细管电泳，可以直观的看到基因型结果，缩短检测周期，提高检测效率；本发明专利技术运用通用型荧光探针，针对不同位点只需要设计发夹引物即可，大大降低研发成本。

A Hairpin Modified Primer Combining Universal Fluorescent Primers

The invention relates to a hairpin modified primer, a kit and an application in the detection of single nucleotide polymorphism combining universal fluorescent primers. The hairpin modified primers include a hairpin sequence, a universal fluorescent primer binding sequence and a specific sequence. The hairpin modified primer provided by the invention has low price and high specificity, greatly reduces the cost by using universal fluorescent primers, and other experimental consumables are cheap and easy to obtain; after a single PCR, capillary electrophoresis can intuitively see the genotype results, shorten the detection cycle and improve the detection efficiency; The invention uses universal fluorescent probes, and only needs to be set up for different sites. The hairpin primers can be used, which greatly reduces the cost of research and development.

【技术实现步骤摘要】
一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物
本专利技术属于生物
，特别涉及一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物、试剂盒以及在单核苷酸多态性检测中的应用。
技术介绍
作为近年来最有发展潜力的第三代分子标记，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)在遗传分析中得到了广泛应用。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的80％以上。SNP是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。目前已经有多种技术检测单核苷酸的多态性，包括一代测序、二代测序、基因芯片技术、等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线等。其中等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)的优势在特异性上尤为突出，但在近几年的实验中发现根据AS-PCR设计出来的引物特异性虽好，但仍有非特异性扩增，即使在引物中引入错配，仍然达不到理想效果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，以克服现有AS-PCR技术末端碱基易错配分辨率不高、易产生非特异扩增的缺点。本专利技术提供了一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列，所述成发夹序列与引物3’端部分碱基序列互补配对但突变碱基处裸露不互补配对，所述通用荧光引物结合序列与通用荧光引物的上游引物序列相同，所述特异序列用于与模板结合。进一步的，所述成发夹序列位于发夹修饰引物5’端，长度为9～15个碱基，该引物在自然状态下自身形成发夹结构。所述成发夹序列3’端裸露的单个碱基只与特异的碱基互补配对，引物错配机率大大降低，进一步更准确的区分不同的突变位点。进一步的，针对同一SNP不同的基因型，一种基因型的通用荧光引物结合序列比另一种基因型的通用荧光引物结合序列长2～4个碱基，且在此区域的3’端一侧长出。通用荧光引物能够与通用荧光引物结合序列的产物互补结合，进行扩增，使产物带有荧光信号，能够进行毛细管电泳。进一步的，所述特异序列位于发夹修饰引物3’端，长度为10～18个碱基。进一步的，针对同一SNP不同的基因型，一种基因型的特异序列与另一种基因型的特异序列最后一个碱基不同，引入的错配碱基不同。进一步的，所述发夹修饰引物对应的下游引物由通用荧光引物下游序列结合区和下游引物依次拼接而成。在PCR时，每一个SNP对应两种发夹引物和一种下游引物，此时，发夹引物形成竞争关系，有利于形成更高的特异性。进一步的，通用荧光引物的上游引物5’端的碱基带有荧光基团标记。所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、ROX、TaxasRed或CY5，优选FAM、HEX。本专利技术中，可针对所有基因型均使用一套通用荧光引物，利用巢式PCR的原理，在前几个循环中，运用发夹引物进行扩增，使产物带有能与通用荧光引物结合的序列，结合后，进行扩增，为目标区域PCR产物加上荧光信号，使其可以在毛细管电泳平台上通过检测荧光信号判断不同基因型。本专利技术在进行多重PCR时，不同位点产物片段不同时，多位点仅需共用一套荧光引物便可实现多个位点的检测，大大降低了成本、简化了实验操作，更易推广和使用。本专利技术还提供了一种包含发夹修饰引物的试剂盒。试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶，Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。本专利技术还提供了一种发夹修饰引物在单核苷酸多态性检测中的应用。具体的，将本专利技术的发夹修饰引物、通用荧光引物在试剂盒中配成体系，PCR扩增后进行毛细管电泳，两种基因型是根据两种发夹引物的通用荧光引物结合区T引物比C引物长3个碱基完成的，在毛细管电泳中可根据不同位置的有无峰来判断基因型。图1为同一SNP的不同基因型对应的引物，两者不同之处在于：1)3-1与3-2区域除了最后一个碱基不同外，还人为的引入错配；2)1-1与1-2区域在人为引入突变处不同；3)2-1与2-2中2-2比2-1多2～4碱基。图2为发夹引物与模板结合时的示意图。其中A是上游发夹引物伸展开的状态，当3’端与模板匹配时，则可以延伸；不匹配时，会从模板上脱落下来，再次形成发夹结构。在首轮循环中，以发夹特异引物为主导的不同基因型特异引物3’端裸露碱基特异识别模板DNA，发夹结构打开，从而形成较长片段的产物，该片段产物一旦形成，高浓度的通用荧光引物进而识别长片段上的通用序列，扩增出较短片段的产物，同时使得不同的基因型产物标记相应的荧光，进而可以在ABI3730等平台上收集不同位置的荧光信号，区分不同样本的基因型态。有益效果本专利技术提供的发夹修饰引物价格低廉且特异性高，运用通用的荧光引物大大降低成本，所需要的其他实验耗材也廉价易得；本专利技术一次PCR后进行毛细管电泳，可以直观的看到基因型结果，缩短检测周期，提高检测效率；本专利技术运用通用型荧光探针，针对不同位点只需要设计发夹引物即可，大大降低研发成本，简化了实验操作，更易推广和使用。附图说明图1为同一SNP的不同基因型对应的引物；其中，1-1和1-2是成发夹序列，2-1和2-2是通用荧光引物结合序列，3-1和3-2是特异序列，X和Y为此引物最后一个碱基，能够与互补配对的样本结合并扩增。图2为本专利技术发夹修饰引物与模板结合时的示意图；其中，A是上游发夹引物伸展开的状态(当3’端与模板匹配时，则可以延伸；不匹配时，会从模板上脱落下来，再次形成发夹结构)，4是通用荧光上游引物，与发夹引物的通用荧光引物结合序列的序列相同，5和6是发夹引物所对应的下游引物，5的序列与通用荧光下游引物7的序列相同，6的序列与模板能够互补。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册,或按照试剂制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂有限公司，dNTPs购自大连宝生物公司，TaqDNA聚合酶购自菲鹏生物股份有限公司，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成，人血DNA抽提采用爱思进生物技术(杭州)有限公司(Axygen公司)血基因组小量制备试剂盒。实施例1利用发夹引物进行AS-PCR检测单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。序列查找和引物设计：根据NCBI的SNP数据库，在人类基因组中查找出与人类叶酸代谢能力相关的3个位点的目标区段序列，使用Oligo6.0按照一般规则进行引物设计，并人工在设计的引物上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，然后用化学方法合成上下游特异引物(表1)。表1SNP检测特异引物注：HP代表发夹引物，其中第一部分的大写字母为成发夹序列，第二部分的小写字母为通用荧光引物结合序列，第三部分为特异序列，倒数几位的小写字母为人为引入的突变。DNA抽提：人血细胞采用血基因组小量制备试剂盒，按照说明书进行抽提得到DNA，以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，从5’到3’依次包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列，所述成发夹序列与引物3’端部分碱基序列形成发夹配对但突变位点处碱基裸露不互补配对，所述通用荧光引物结合序列的扩增产物用于与通用荧光引物结合而进行通用荧光引物的扩增，所述特异序列用于与模板结合。

【技术特征摘要】
1.一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，从5’到3’依次包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列，所述成发夹序列与引物3’端部分碱基序列形成发夹配对但突变位点处碱基裸露不互补配对，所述通用荧光引物结合序列的扩增产物用于与通用荧光引物结合而进行通用荧光引物的扩增，所述特异序列用于与模板结合。2.根据权利要求1所述的发夹修饰引物，其特征在于：针对不同的基因型，所说的通用荧光引物结合序列的3’端区域有2～4个碱基的长度差异。3.根据权利要求1所述的发夹修饰引物，其特征在于：针对不同的基因型，所说的发夹修饰引物的3’端最后一个碱基不同。4.根据权利要求1所述的发夹修饰引物，其特征在于：针对不同的基因型，在所说的发夹修饰引物的3...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖君华，刘红红，汤晨，
申请(专利权)人：上海翼和应用生物技术有限公司，东华大学，
类型：发明
国别省市：上海,31