猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用，包括如下步骤：（1）SVV/GD05株基因组全序列的扩增；（2）pSVV‑GD05病毒感染性克隆质粒的构建；（3）pSVV‑GD05‑iLOV重组质粒的构建；（4）亲本病毒（SVV‑GD05）与重组病毒（SVV‑GD05‑iLOV）拯救。本发明专利技术利用一株分离自中国猪群的SVV毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆pSVV‑GD05，并能成功拯救出病毒。同时，将报告基因iLOV插入SVV感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该报告基因的重组SVV病毒。本发明专利技术为深入开展SVV的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。

Preparation and application of full-length infectious clone of pig Seneca virus

The invention relates to the preparation method and application of full-length infectious clones of pig Seneca virus, including the following steps: (1) amplification of the complete genome sequence of SVV/GD05 strain; (2) construction of infectious clone plasmid of pSVV GD05 virus; (3) construction of recombinant plasmid of pSVV GD05 iLOV iLOV; (4) parent virus (SVV GD05) and recombinant virus (SVV GD05 GD05 iLOV) to save. The present invention constructs a viral infectious clone pSVV GD05 with bacterial plasmid as its skeleton by using a SVV strain isolated from Chinese pig herds, and can successfully rescue the virus. At the same time, the reporter gene iLOV was inserted into the genome of the infectious cloned virus of SVV, and the recombinant SVV virus expressing the reporter gene was successfully rescued. The invention provides an effective platform for further research on the basis and application of SVV, and has important scientific application value.

【技术实现步骤摘要】
猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用
本专利技术涉及猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用。
技术介绍
塞内卡病毒(SenecaValleyVirus,SVV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员，其基因组为单股正链RNA，长度约为7.28kb。病毒基因组由5’端非编码区(0.66Kb)，开放阅读框(ORF，6.54Kb)，3’端非编码区(0.07Kb)和多聚腺苷酸(polyA)组成。ORF是由L基因、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因组成,共同编码一条长的多聚蛋白。这条聚合蛋白遵循L-4-3-4模式，经蛋白酶剪切后能被加工成12个结构和非结构蛋白，分别是L，1A(VP4)，1B(VP2)，1C(VP3)，1D(VP1)，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。SVV-VP1基因序列分析显示，现有的SVV毒株可分为3个分支，分支1包括2002年分离的SVV-001株，分支2包括1988-1997年美国分离株，分支3包括巴西、加拿大、中国分离株和2001-2015年美国分离株。遗传进化树分析表明，近30年来SVV已发生变异，致病性明显增强。迄今为止，国内外研究人员对SVV在病毒生物学特性、致病机理、诊断试剂和疫苗研究等方面做了一些工作。但是，目前仍然缺乏有效的防控手段。因此，深入开展病毒的分子生物学特性、复制机制、致病机理等研究，将有利于我们全面透彻的了解SVV，从而为开发高效的SVV诊断试剂和疫苗提供理论依据。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术的目的是提供一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用。本专利技术利用一株分离自中国猪群的SVV毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒。同时，将报告基因iLOV插入SVV感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该报告基因的重组SVV病毒。本专利技术为深入开展SVV的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物，包括如下引物：本专利技术还提供一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：(1)SVV/GD05株基因组全序列的扩增；(2)pSVV-GD05重组质粒的构建；(3)pSVV-GD05-iLOV重组质粒的构建；(4)亲本病毒(SVV-GD05)与重组病毒(SVV-GD05-iLOV)拯救；步骤(1)、(2)和(3)中，使用权利要求1所述的猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物。步骤(1)和(2)中，提取SVV/GD05株的RNA，经过反转录得到cDNA；以cDNA为模板分别用扩增片段B、C、E、F的引物通过PCR扩增得到B、C、E、F片段；以A、D的引物扩增分别得到A、D片段；分别用引物对CMV-F/967R、7381F/8213R通过overlap，得到AB、CD片段后，将AB片段克隆至pEGFP-C3载体，得到pC3-GD05-AB；将CD片段插入pC3-GD05-AB，得到重组质粒pC3-GD05-ABCD；最后将E，F片段插入pC3-GD05-ABCD，得到pSVV-GD05。步骤(3)中，用引物对VP-1465F/LOV-R3扩增得到P片段；以pSVV-GD05质粒为模板，用引物对2B-F3/2B-R，2B-F2/3C-R1分别扩增得到Q1和2C-3C；将Myc-T2A-F与Q1基因片段先进行三个PCR循环后,加入引物Myc-F1/2B-R，进行PCR扩增，通过overlap得到Q片段；将P、Q、2C-3C插到pSVV-GD05，最后得到pSVV-GD05-iLOV。步骤(4)中，pSVV-GD05转染BHK-21细胞后，可拯救亲本病毒SVV-GD05；而pSVV-GD05-iLOV转染BHK-21细胞后，可拯救重组病毒SVV-GD05-iLOV。本专利技术还提供前述的引物或前述的制备方法在制备SVV诊断试剂和/或疫苗中的应用，以及前述的制备方法制备的猪塞内卡病毒全长感染性克隆。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术利用一株分离自中国猪群的SVV毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒。同时，将报告基因iLOV插入SVV感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该报告基因的重组SVV病毒。本专利技术为深入开展SVV的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。插入报告基因到小RNA病毒基因组中，一般病毒传至3-5代后，报告基因出现大量的缺失，表明外源基因在病毒基因组中不稳定；而本专利技术的SVV-GD05-iLOV，传到第10代，报告基因仍然稳定存在于病毒基因组，未发现基因缺失现象。此种报告病毒可用作工具，在该病毒的基础和应用研究中起重要作用。附图说明图1:SVV基因组结构图：A:SVV-GD05基因组结构图；B:SVV-GD05-iLOV基因组结构图；图2:病毒感染ST-R细胞：A:SVV-GD05病毒感染ST-R细胞IFA(20×)；B:正常ST-R细胞(20×)；C:SVV-GD05-iLOV病毒感染ST-R细胞(10×),D:SVV-GD05-iLOV病毒感染ST-R细胞(20×)；图3:SVV-GD05-iLOV感染ST-R细胞，RT-PCR验证SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的遗传稳定性：1:pSVV-GD05；2:pSVV-GD05-iLOV；3、4、5分别是SVV-GD05-iLOV感染ST-R细胞，获得的P3、P6和P10代病毒液；图4:SVV-GD05-iLOV感染ST-RIFA(63×)：A：使用抗Myc标签兔单克隆抗体检测；B:使用抗VP1蛋白单克隆抗体检测；C:正常ST-RDAPI染色；图5:SVV-GD05与SVV-GD05-iLOV感染ST-R细胞，WesternBlot检测分析结果；图6:SVV-GD05和SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的空斑：A:SVV-GD05,B：SVV-GD05-iLOV；图7:SVV-GD05和SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的生长动力学曲线。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。1材料与方法1.1病毒、细胞、菌株及参考序列SVV/GD05毒株(GenBankaccessionnumbers:MH316116)于2017年底分离自广东某猪场，由本实验室分离保存。BHK-21细胞、ST-R细胞(猪睾丸细胞)、pEGFP-C3载体、大肠杆菌TOP10感受态细胞由本实验室保存。1.2主要试剂和仪器限制性内切酶、PrimeSTARTMDNAPolymerase、TaqTM、TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit、PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit、DL5000DNAmarker均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；AgaroseGelDNAPurificationKit购自Axygen；GibsonAssemblyKit购自NEB；VP1单抗由本实验室提供；Dylight549,GoatA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物，其特征在于，包括如下引物：

【技术特征摘要】
1.猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物，其特征在于，包括如下引物：，2.一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：(1)SVV/GD05株基因组全序列的扩增；(2)pSVV-GD05重组质粒的构建；(3)pSVV-GD05-iLOV重组质粒的构建；(4)亲本病毒SVV-GD05与重组病毒SVV-GD05-iLOV拯救；步骤(1)、(2)和(3)中，使用权利要求1所述的猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物。3.根据权利要求2所述的一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，提取SVV/GD05株的RNA，经过反转录得到cDNA；以cDNA为模板，分别用引物对通过PCR扩增得到B、C、E、F片段；以A、D的引物扩增分别得到A、D片段；分别用引物对CMV-F/967R、7381F/8213R通过overlap，得到AB、CD片段；然后将AB片段克隆至pEGFP-C3载体，得到pC3-GD05-AB；将CD片段插入pC3-GD05-AB，得到重组质粒pC3-GD05-ABCD；最后将E...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振海，王敏敏，孙怀昌，张鑫宇，周晓慧，牟春晓，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32