一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物及利用其进行测序的方法技术

本发明专利技术涉及一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物及利用其进行测序的方法，所述引物序列为CytbMOSF:TTTCAGCTYGATGAAATTTTGG；CytbMOSR:TATAAAACWGTTAAAATTTG，所述方法包括步骤1：提取待测样本模板DNA；步骤2：对步骤1中提取的待测样本的模板DNA进行PCR扩增；步骤3：将步骤2中PCR扩增产物进行电泳确定；步骤4：对步骤3中确定后的PCR产物进行DNA序列测定。利用蚊科昆虫Cytb基因特异性引物，采用相应测序方法，快速准确得扩增出基因序列，为后续Cytb基因进行病媒生物蚊科昆虫的分子鉴定和溯源提供基础。

A Method for Amplifying and Sequencing Cytb Gene Specific Primers in Mosquitoes

The present invention relates to a method for amplifying and sequencing Cytb gene-specific primers of mosquitoes. The sequence of the primers is CytbMOSF: TTTCAGCTYGATGAAATTGG; CytbMOSR: TATAAAACWGTTAATTTG. The method comprises steps 1: extracting template DNA from the sample to be tested; step 2: amplifying template DNA from the sample to be tested in step 1; step 3: amplifying the template DNA in step 2 by PCR. The amplified products were determined by electrophoresis; Step 4: DNA sequencing of the PCR products determined in Step 3. Using the specific primers of Cytb gene of mosquitoes and the corresponding sequencing method, the gene sequence was amplified rapidly and accurately, which provided the basis for molecular identification and traceability of vector insects of mosquitoes.

【技术实现步骤摘要】
一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物及利用其进行测序的方法
本专利技术涉及本专利涉及基因工程及分子生物学领域，尤其涉及国境口岸或国内卫生安全领域的病媒生物蚊科昆虫的分子鉴定和溯源。
技术介绍
随着自然条件的变化以及国际交通、贸易和旅游业的发展，生物入侵(包括病媒生物入侵)日益成为一个严重的国际生态和卫生安全问题。生物多样性公约组织报告显示，生物入侵给世界各国造成了重大的经济损失。其中，美国每年损失1370亿美元；印度1170亿美元；巴西500亿美元；南非70亿美元。病媒生物作为入侵物种的特有一种，因其可能携带人类易感病原体而备受国际社会关注。越来越多的病媒生物可随交通工具、集装箱、货物等被有意或无意地带至新的区域，其中的许多物种与本地物种竞争营养、水分和生存空间而在其传入地建立种群并大量繁殖、扩散，排挤本地物种，破坏生态平衡。占据优势的外来病媒生物不仅使得相关传染病病爆发、流行的潜在风险加大，而且有新发传染病出现的可能。历史上多次发生由病媒生物的入侵造成疾病的爆发流行的事例。如1930年，冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)随邮船从西非的塞内加尔输入到巴西，并在巴西东北部大量孳生繁殖，导致巴西1939～1940年的疟疾流行。近30余年来，西欧已经发生63起“航空港疟疾”事件，均为飞机将感染疟原虫的媒介按蚊输入，并传播给当地居民。1975年，1名罗斯河病毒携带者到达斐济，在机场被蚊叮咬导致该病传播，引起斐济全岛罗斯河病毒大流行。1998年，一艘汽船将染有鼠疫杆菌的褐家鼠从印度带到马达加斯岛，鼠疫在该岛开始出现。2000年，埃及伊蚊在位于太平洋的复活节岛被发现，两年后，该岛暴发流行登革热，发病率达16.6％。而近年来，全球相继出现了登革热、黄热病、寨卡病毒病爆发，这些疾病的传播途径均为病媒生物蚊科昆虫。为此，国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)已将“危险传播媒介鉴别与防治技术、生物入侵防控技术”研究列入国家公共安全研究的优先发展主题。研究表明，当外来蚊种进入一个过去不曾分布的区域，并能存活、繁殖、形成野化种群，其种群进一步扩散已经或将造成明显的环境、健康、经济后果，这一过程成为入侵。一般将入侵的过程分为传入、定殖、扩散三个阶段，或更细分为传入期、归化期、促进期、停滞期、与本地生物互动期和稳定期等。输入性蚊类的确定有助于防止外来新种的定殖、扩散、成为优势蚊种，向评估本底蚊种群构成是否处于平衡状态提供科学依据。更为重要的是，识别输入性蚊类是遏制传染病输入、爆发、流行的第一道防线。本研究以山东口岸及周边地区的蚊为代表，应用mtDNACytb基因研究其遗传多样性及系统发育，并以该数据作为本底值，借助MEGA等软件构件系统发育树，测量疑似输入个体与本底值之间的遗传差距，用以蚊科遗传多样性分析及输入性蚊种的确认，为防止传染病的输入、爆发、流行提供有力的技术支撑，为保障口岸卫生安全提供坚实的科学依据。线粒体DNA基因组具有分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、与核基因组无共同序列、进化速率快、多拷贝及分子钟理论等优点，比核DNA更容易检测，亲缘关系相关或相近的物种都能得到区分和鉴定。目前，常用的mtDNA分子标记有很多，包括：Cytb基因、12SrRNA基因、16SrRNA基因、D-loop控制区、ND基因和CO基因。其中，Cytb基因由于其独具的优势而被广泛地研究应用。细胞色素b(Cytochromeb，Cytb)起源非常古老，在几乎所有的真核生物和许多原核生物的细胞中都有发现。它不但在属间、种间存在多样性，而且在品种间、品种内个体间都存在多样性。因此，它对阐明生物的亲缘关系以及物种鉴定方面都有极其重要的意义。许多学者应用Cytb基因对不同水生动物遗传结构进行分析，计算了松江鲈出现中国和日本两个世系的遗传距离，推测了他们的分化时间；而长臀鮠、波纹唇鱼由于洋流和游泳能力的影响未出现明显分化。张云生等应用Cytb基因发现中国家驴5个家驴品种共有2个母系起源即索马里和努比亚支系。除有学者对枣实蝇、水生半翅目昆虫的分子进化进行研究外，Cytb基因在昆虫分子进化和遗传距离研究上鲜见。有双翅目昆虫线粒体基因组通用引物的发表，但无法特异的扩增蚊科昆虫Cytb基因，无法通过扩增筛选是否为蚊科昆虫。专利检索，未见以“Cytb”、“蚊”为关键词的专利。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物及利用其进行测序的方法，利用蚊科昆虫Cytb基因特异性引物，采用相应测序方法，快速准确得扩增出基因序列，为后续Cytb基因进行病媒生物蚊科昆虫的分子鉴定和溯源提供基础。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物，所述引物序列为：CytbMOSF:TTTCAGCTYGATGAAATTTTGG；CytbMOSR:TATAAAACWGTTAAAATTTG。本专利技术的有益效果是：本专利技术得到的引物有着非常好的扩增性能，对蚊科昆虫Cytb基因的扩增，最后均能获得明亮的条带，有利于后续研究大规模用该引物进行扩增，用本专利技术得到的引物对多个蚊科个体Cytb基因进行扩增，均得到特异性产物，为后续Cytb基因进行病媒生物蚊科昆虫的分子鉴定和溯源提供基础。一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物在蚊科昆虫线粒体Cytb基因的扩增、测序中的应用。一种利用蚊科昆虫Cytb基因特异性引物进行测序的方法，包括如下步骤：步骤1：提取待测样本模板DNA；步骤2：对步骤1中提取的待测样本的模板DNA进行PCR扩增；步骤3：步骤2中PCR扩增产物的电泳确定；步骤4：对步骤3中确定后的PCR产物进行DNA序列测定。本专利技术的有益效果是：本方法简单易行，能够快速而又准确的得到蚊科昆虫Cytb基因序列。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，所述步骤1中利用试剂盒提取待测样本模板DNA。采用上述进一步方案的有益效果是：保证待预测样品模板DNA提取的准确性，避免外界因素的干扰。进一步，所述步骤2中PCR扩增体系按照体积份数计包括：PrimeSTARHS(Premix)25.0份、10.0μlmmol/LCytbMOSF2.0份、10μlmmol/LCytbMOSR2.0份、DNA模板2.0份，DEPC水19.0份。采用上述进一步方案的有益效果是：为PCR提供必要的物质，保证PCR产物的数量和质量。进一步，所述步骤2中PCR程序为94℃5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min共30个循环；最后72℃延伸5min。采用上述进一步方案的有益效果是：准确控制温度时间及保存温度，保证PCR过程有序进行，产物的特异性扩增。进一步，所述步骤3中PCR产物的电泳为1.5％琼脂糖凝胶电泳。采用上述进一步方案的有益效果是：制备容易，操作简单、快速，分离范围广，且能够有效检测扩增效果,大大提高了分辨水平。附图说明图1为本专利技术灵敏度实验扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1-15泳道分别为不同浓度三带喙库蚊DNA进行PCR扩增产物，16泳道为阴性对照，17泳道为DL2000Marker；图2为本专利技术特异性实验扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1-22泳道分别为淡色库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、褐家本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物，所述引物序列为：CytbMOSF:TTTCAGCTYGATGAAATTTTGG；CytbMOSR:TATAAAACWGTTAAAATTTG。

【技术特征摘要】
1.一种扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物，所述引物序列为：CytbMOSF:TTTCAGCTYGATGAAATTTTGG；CytbMOSR:TATAAAACWGTTAAAATTTG。2.一种如权利要求1中所述的扩增蚊科昆虫Cytb基因特异性引物在蚊科昆虫线粒体Cytb基因的扩增、测序中的应用。3.一种利用蚊科昆虫Cytb基因特异性引物进行测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：提取待测样本模板DNA；步骤2：对步骤1中提取的待测样本的模板DNA进行PCR扩增；步骤3：将步骤2中PCR扩增产物进行电泳确定；步骤4：对步骤3中确定后的PCR产物进行DNA序列测定。4.根据权利要求3所述一种利用蚊科昆虫Cytb基因特异性引物进行测序的方法，其特征在于，步骤1中利用试剂盒提取待测样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，段效辉，方绍庆，钟响，李金庆，高娟娟，
申请(专利权)人：烟台国际旅行卫生保健中心，烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37