一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。与传统的基于MRS平板筛选以及16S rRNA比对的方法相比，本发明专利技术的方法基于卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物，这使得本发明专利技术的方法仅需通过一次PCR扩增、一次琼脂糖凝胶电泳检测，无需测序，即可鉴定出菌株是否为卷曲乳杆菌，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果；利用本发明专利技术的方法进行卷曲乳杆菌的筛选以及鉴定，准确性较高，在发明专利技术涉及的卷曲乳杆菌样本内，准确率为100％。

A Method for Screening and/or Identifying Lactobacillus Curvulus and Its Application

The invention discloses a method for screening and/or identifying Lactobacillus curvulus and its application, which belongs to the field of microbial technology. Compared with the traditional method based on MRS plate screening and 16S rRNA comparison, the method of the invention is based on the core DNA fragment of the Lactobacillus curl genome and the specific primers that can be used to amplify the core DNA fragments of the Lactobacillus genome, so that the method of the invention can only be identified by one PCR amplification and one agarose gel electrophoresis detection without sequencing. Whether the strain is Lactobacillus curvulus or not greatly shortens the detection time, improves the detection efficiency, has the effect of simplicity and economy; the method of the invention is used to screen and identify Lactobacillus curvulus with high accuracy, and the accuracy is 100% in the sample of Lactobacillus curvulus involved in the invention.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用
本专利技术涉及一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用，属于微生物

技术介绍
卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)是Brygoo和Aladame于1953年发现的一类革兰氏阳性菌，属于乳杆菌科乳杆菌属，主要分离自人体肠道、生殖道、鸡嗉囊和盲肠，是我国食品目录可用菌株。大量国内外研究表明，卷曲乳杆菌具有调节免疫、改善过敏、抗肿瘤等益生功能。此外，卷曲乳杆菌作为女性生殖道内主要优势菌株，可通过产生抗菌物质，竞争粘附及调节免疫等作用，抑制生殖道病原菌的生长，对于维持女性生殖道健康具有重要意义。因此，筛选大量不同来源的卷曲乳杆菌，构建卷曲乳杆菌资源库，对于挖掘我国益生菌的资源、选择具有优良益生特性的卷曲乳杆菌用于治疗和预防女性生殖道疾病意义重大。传统的基于天然生长环境的卷曲乳杆菌的筛选方法主要是先将人体粪便、女性生殖道拭子、鸡粪等以一定比例梯度稀释后，涂布于MRS平板筛选，然后将得到的菌株通过生理生化特性及16SrRNA测序进行鉴定。但是，由于MRS平板的选择性较差，往往一个样品需要挑取大量的菌株才有可能得到1～2株目的菌，这使得传统的基于天然生长环境的卷曲乳杆菌的筛选方法操作繁琐且成本较高，盲目性高且容易漏筛，不适于卷曲乳杆菌资源库的快速建立。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种准确性和效率更高的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段，所述DNA片段为卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段和/或可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物；所述卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3所示；或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4以及SEQIDNO:5所示；或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6以及SEQIDNO:7所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供了一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，先提取需筛选或鉴定样本的基因组DNA，然后将提取得到的基因组DNA用上述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，最后将扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产生特异性扩增条带，则表明待筛选的样品中含有卷曲乳杆菌或待鉴定的菌株为卷曲乳杆菌；或者，先将需筛选或鉴定样本进行分离培养，得到单菌落，再挑取单菌落进行培养，得到菌液，接着将得到的菌液离心后用无菌水重悬，得到扩增模板，然后将得到的扩增模板用权利要求1-3任一所述的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，得到扩增片段，最后将得到的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产生特异性扩增条带，则表明待筛选的样品中含有卷曲乳杆菌或待鉴定的菌株为卷曲乳杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3所示；或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4以及SEQIDNO:5所示；或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6以及SEQIDNO:7所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述特异性扩增条带的大小为764bp。本专利技术还提供了一种可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物。在本专利技术的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供了上述可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段或上述一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法或上述一种可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的试剂盒在筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌方面的应用。[有益效果](1)与传统的基于MRS平板筛选以及16SrRNA比对的方法相比，本专利技术的方法基于卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物，这使得本专利技术的方法仅需通过一次PCR扩增、一次琼脂糖凝胶电泳检测，无需测序，即可鉴定出菌株是否为卷曲乳杆菌，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果；(2)利用本专利技术的方法进行卷曲乳杆菌的筛选以及鉴定，准确性较高，在专利技术涉及的卷曲乳杆菌样本内，准确率为100％。附图说明图1：53株已知卷曲乳杆菌MCL聚类结果的韦恩图。图2：卷曲乳杆菌标准菌株ST1的675个同源基因的蛋白序列与已知39株乳杆菌属其他乳杆菌的蛋白序列的MCL聚类结果的韦恩图。图3：实施例3中方法A的分离自粪便和生殖道样品中的20株卷曲乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为阴性对照，2～21为卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)。图4：实施例4中方法A的分离自粪便和生殖道样品中的22株乳杆菌属其他乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)，2为阴道乳杆菌(Lactobacillusvaginal)，3为弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)，4为格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)，5为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，6为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，7为唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，8为食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)，9为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，10为瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)，11为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)，12为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，13为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，14为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，15为鸡乳杆菌(Lactobacillusgallinarum)，16为清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)，17为能动乳杆菌(Lactobacillusagilis)，18为干酪乳杆菌(Lactob本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段为卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段和/或可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物；所述卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段为卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段和/或可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物；所述卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段，其特征在于，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3所示；或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4以及SEQIDNO:5所示；或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6以及SEQIDNO:7所示。3.如权利要求1所述的可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段，其特征在于，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3所示。4.一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，其特征在于，先提取需筛选或鉴定样本的基因组DNA，然后将提取得到的基因组DNA用权利要求1-3任一所述的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，最后将扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产生特异性扩增条带，则表明待筛选的样品中含有卷曲乳杆菌或待鉴定的菌株为卷曲乳杆菌；或者，先将需筛选或鉴定样本进行分离培养，得到单菌落，再挑取单菌落进行培养，得到菌液，接着将得到的菌液离心后用无菌水重悬，得到扩增模板，然后将得到的扩增模板用权利要求1-3任一所述的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，得到扩增片...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，张秋香，张丽丽，赵建新，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32