用于检测样品中微生物的方法技术

公开了一种用于检测样品中至少一种特定微生物的方法，其中提供了探针核酸序列，其包含至少一种能够发射至少一种可检测信号的可检测标记，其中当探针序列未与靶序列结合时，可检测信号取第一值，当探针序列与靶序列结合时，可检测信号取第二值。测量和分析了探针核酸序列的可检测信号的至少一个值，其中如果测量值对应于可检测信号的第二值，则表明样品含有微生物。可以检测与靶序列(信号(2))杂交的探针序列和不与任何靶标(信号(1))结合的对照序列之间的显著差异。在杂交过程的所有阶段(加热、静止和冷却)中，可检测信号(2)的值高于对照信号(1)的值，其中可以在冷却阶段(Δ3)结束时观察到最显著的差异，使得在此期间测量和分析可检测信号(2)提供最可靠的结果。可替代地或可选地，可以设置其他阶段(Δ1和/或Δ2)中的附加测量点以增强结果的可靠性。

A Method for Detecting Microorganisms in Samples

A method for detecting at least one specific microorganism in a sample is disclosed, which provides a probe nucleic acid sequence comprising at least one detectable marker capable of transmitting at least one detectable signal, in which the detectable signal takes the first value when the probe sequence is not combined with the target sequence and the detectable signal takes the second value when the probe sequence is combined with the target sequence. At least one value of the detectable signal of the probe nucleic acid sequence is measured and analyzed. If the measured value corresponds to the second value of the detectable signal, the sample contains microorganisms. Significant differences between probe sequences hybridized with target sequences (signal (2) and control sequences not bound to any target (signal (1) can be detected. In all stages of the hybridization process (heating, resting and cooling), the detectable signal (2) is higher than the control signal (1), and the most significant difference can be observed at the end of the cooling stage (3), which enables the measurement and analysis of detectable signal (2) to provide the most reliable results during this period. Alternatively or alternatively, additional measurement points in other stages (1 and/or 2) may be set up to enhance the reliability of the results.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测样品中微生物的方法
本专利技术涉及用于检测样品中至少一种特定微生物的方法，其中至少一种探针核酸序列能够与所述微生物的至少一种靶核酸序列杂交，所述探针核酸序列包含至少一种能够发射至少一种可检测信号的可检测标记，其中当探针序列未与靶序列结合时，可检测信号取第一值，当探针序列与靶序列结合时，可检测信号取第二值，其中与可检测信号的第一值相比，可检测信号的第二值减小、增加或改变。本专利技术进一步涉及用于检测样品中至少一种特定微生物的组合物和试剂盒。
技术介绍
快速和可靠地检测生物样品(例如血液、痰和其他分泌物)中的微生物(例如病原体细菌)仍然是人类健康护理中的问题，特别是在医院中。然而，在护理时快速诊断传染病是非常重要的,以便快速启动或适用抗生素治疗并从而改善患者护理。由于住院时间较短，对危重传染病的快速诊断也有助于大幅节省成本。例如，社区获得性肺炎(CAP)仍然是全世界发病率和死亡率的主要原因。肺炎链球菌、肺炎支原体、甲型流感病毒(InfA)、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒(AdV)等被认为是CAP的重要原因。尽管努力寻找细菌和病毒病原体作为CAP患者的病原因子的证据，但在高达50％的患者中病因仍然难以捉摸，影响了有效治疗。在国家和卫生保健机构之间观察到致病病原体的差异，但用于鉴定致病因子的方法的差异也导致不同数量的患病率。缺乏鉴定病原体的敏感方法增加了问题。在医院获得性肺炎中，非常需要一种即时诊断设备(POC)，因为没有经典鉴定方法的良好替代品。金标准是培养，它没有显示出非常好的灵敏度并且是耗时的。希望获得患者实际情况的准确、最新详情，特别是在重症监护病房。已知引起细菌的问题可以相当快速地变换，必须基于患者的当前情况做出治疗决定。基于自动化PCR的诊断工具，如(CuretisAG，霍尔茨格尔林根，德国)或系统(BiofireDiagnostics，盐湖城，美国)需要高额资本投资，成本非常高，仅限于所需的样品材料(例如：仅拭子)，因此不太可能用于常规诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测样品中的特定微生物的快速且低成本的方法，其允许直接从多种样品材料(例如血液培养物或痰液)中非侵入性地检测微生物，而无需扩增或培养。该目的通过最初指定的方法实现，包括：a)提供怀疑包含微生物的样品；b)穿孔或裂解样品内的微生物；c)在允许探针序列与靶序列体外杂交的条件下将探针核酸序列添加到样品中；d)在一个或多个时间点测量样品中探针核酸序列的可检测信号的至少一个值；以及e)分析探针核酸序列的可检测信号的测量值，其中如果测量值对应于可检测信号的第二值，则表明样品含有微生物。根据本专利技术的方法提供了一种有利的解决方案，其可以直接在例如呼吸道样品的样品中(即，限定体积的水溶液或悬浮液)非侵入性地检测和鉴定特定微生物，而无需扩增或培养。例如，使用荧光标记的探针，根据本专利技术的方法不仅可以在一个简单的多重测试中区分和鉴定多个细菌菌株，而且还可以通过使用充当阳性对照的通用探针排除细菌感染。整个测试过程仅需约15分钟即可完成，分析灵敏度非常高(检出限约为104-106cfu/ml，cfu为菌落形成单位)。根据本专利技术的方法简单且成本有效，并且不需要高技能化人员。此外，根据本专利技术的方法可以开辟对多种(例如，多达20种)不同细菌菌株的细菌负荷进行半定量化的可能性(至少在检出限的较高端)，从而允许在护理时监测患者。在本专利技术的示例性和有利的实施例中，所述条件，其允许探针序列与靶序列的体外杂交，包括将样品的温度至少暂时升高至高于室温的预定温度。例如，步骤c)中的体外杂交可以在约30℃至约65℃之间的温度下进行，特别是在约35℃至约59℃之间。特别地，温度可以是约52℃。如本文所用，“加热”或“将样品的温度升高至高于室温的温度”是指其中将热能转移至样品以使其温度从约20-25℃(室温或环境温度)升高至30℃以上的温度的过程。这种过程可以例如使用能够将热量传递到包括样品的容器的加热装置(例如，散热器组)来实现。步骤c)中体外杂交的温育时间可以是约1至约30分钟，特别是至多15分钟或至多10分钟，特别是约15分钟或约10分钟。优选的温育时间为约2-约6分钟。更优选地温育约4分钟。步骤d)中样品中的可检测信号的值的测量和步骤e)中测量值的分析都可以连续完成，其中一旦步骤e)中的分析表明样品含有微生物，就可以停止测量。例如，可以在分析的信号产生反应过程中的某些时刻或在分析的反应结束时指示微生物的检测。在任何情况下，如本文所用的连续测量是指沿着分析的信号产生反应的过程在多个测量点处实时确定可检测标记的值。在本专利技术的另一个示例性和有利的实施例中，至少步骤d)和e)自动进行，并且测量值以电子方式读出并以数字方式处理。例如，根据本专利技术的方法适合于通过自动读取器系统实现，例如ESEQuantTubeScanner(Qiagen，希尔登，德国)或AXXINT16-ISO荧光检测系统(AXXIN，费尔菲尔德，澳大利亚)。因此，根据本专利技术的方法非常适合于自动化并且可以在没有高技能化人员的情况下执行。自动化使诊断方法不仅容易而且速度非常快。例如，在制备样品之后，其可以包括用裂解缓冲液液化和/或稀释样品并且仅花费约1分钟，可以在仅15分钟内完成从自动读取器系统读出结果。因此，可以在护理时非常快速地进行特定微生物的检测和鉴定，从而可以在感染的早期阶段开始对患者的有效治疗。在本专利技术的另一个示例性和有利的实施例中，在步骤c)之后在预定的一段时间(温育期)内将温度保持恒定，以确定尽可能多的探针核酸序列准备与靶核酸序列杂交。为了确保分析的准确性和可靠性，可以在温度保持恒定的同时测量样品中可检测信号的至少一个值。如本文所用，“保持温度恒定”是指控制样品温度，使得其温度在一定时间内不会变化超过约1℃或2℃的过程在本专利技术的另一个示例性和有利的实施例中，在步骤c)之后，冷却样品。可以在冷却期间和/或冷却之后测量样品中可检测信号的至少一个值。通过在冷却期间或之后测量信号来增加分析的准确性和可靠性，因为至少在使用分子导标探针时，在较低温度下，从未结合的探针发射的信号被消除或至少降低。如本文所用，“冷却”是指从样品中抽出热能以使其温度从高于30℃的温度降低至较低温度，特别是约20-25℃的过程。例如，可以使用能够从包括样品的容器中抽出热量的冷却装置(例如，散热器组)来实现这种过程。基本上，在整个过程中的任何时间点测量可检测信号的一个值应该足以获得可靠的结果。然而，测量样品中可检测信号的至少一个附加值可以进一步增强该方法的可靠性和准确性。而且，该实施例使得可以在分析的信号产生反应完全完成之前停止测量。例如，探针核酸序列可以是线性核酸或分子导标。探针核酸序列尤其可以是能够在体外条件下与微生物中的靶核酸序列特异性杂交的寡核苷酸。本领域技术人员知道探针核酸序列与靶序列选择性杂交的合适条件。寡核苷酸可具有至多50个核苷酸的长度，例如10至50个核苷酸。寡核苷酸可以是线性寡核苷酸。可替代地，寡核苷酸可以是分子导标，例如在WO2008/043543A2中描述的，其公开内容通过引用并入本文中。分子导标杂交的合适条件也在WO2008/043543A2中示例性地描述。如本文所用，分子导标可以是能够与靶核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测样品中至少一种特定微生物的方法，其中至少一种探针核酸序列能够与所述微生物的至少一种靶核酸序列杂交，所述探针核酸序列包含至少一种能够发射至少一种可检测信号的可检测标记，其中当探针序列未与靶序列结合时，可检测信号取第一值，当探针序列与靶序列结合时，可检测信号取第二值，其中与可检测信号的第一值相比，可检测信号的第二值减小、增加或改变，所述方法包括：a)提供怀疑为包含微生物的样品；b)穿孔或裂解样品内的微生物；c)在允许探针序列与靶序列体外杂交的条件下将探针核酸序列添加到样品中；d)在一个或多个时间点测量样品中探针核酸序列的可检测信号的至少一个值；以及e)分析探针核酸序列的可检测信号的测量值，其中如果测量值对应于可检测信号的第二值，则表明样品含有微生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.29 EP 16186104.21.用于检测样品中至少一种特定微生物的方法，其中至少一种探针核酸序列能够与所述微生物的至少一种靶核酸序列杂交，所述探针核酸序列包含至少一种能够发射至少一种可检测信号的可检测标记，其中当探针序列未与靶序列结合时，可检测信号取第一值，当探针序列与靶序列结合时，可检测信号取第二值，其中与可检测信号的第一值相比，可检测信号的第二值减小、增加或改变，所述方法包括：a)提供怀疑为包含微生物的样品；b)穿孔或裂解样品内的微生物；c)在允许探针序列与靶序列体外杂交的条件下将探针核酸序列添加到样品中；d)在一个或多个时间点测量样品中探针核酸序列的可检测信号的至少一个值；以及e)分析探针核酸序列的可检测信号的测量值，其中如果测量值对应于可检测信号的第二值，则表明样品含有微生物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述条件，其允许探针序列与靶序列的体外杂交，包括将样品的温度至少暂时升高至高于室温的预定温度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤d)中样品中的可检测信号的值的测量，和步骤e)中测量值的分析都可以连续完成，其中一旦步骤e)中的分析表明样品含有微生物，就可以停止测量。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，至少步骤d)和e)自动进行，并且测量值以电子方式读出并以数字方式处理。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在步骤c)之后，在预定的时间段内将温度保持恒定。6.根据权利要求5所述的方法，其中，在温度保持恒定的同时测量样品中可检测信号的至少一个值。7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在步骤c)之后，冷却样品。8.根据权利要求7所述的方法，其中，在冷却期间和/或冷却之后测量样品中可检测信号的至...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·冯施泰因，M·施坦格，
申请(专利权)人：梅塔系统因迪戈有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE