定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物技术

本发明专利技术公开了定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；2)、用成套引物分别对稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行PCR扩增，再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；计算待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量；本发明专利技术为一种检测快、成本低、特异性强、灵敏度高、可重复性好的广谱检测硫酸盐还原菌的方法。

Quantitative Detection of Sulfate Reducing Bacteria and Special Primers

The invention discloses a method for quantitative detection of sulfate reducing bacteria and a special primer. The method of the invention includes the following steps: 1) extracting genomic DNA of bacteria in the sample to be tested and obtaining standard solution of different plasmid DNA copy numbers; 2) amplifying genomic DNA of bacteria in the standard solution of different plasmid DNA copy numbers diluted and the sample to be tested by PCR with a set of primers, and then using pairs of different plasmid DNA copy numbers of diluted standard solution. The value is abscissa, the initial cycle of fluorescence quantitative PCR amplification reaction of standard solution with different plasmid DNA copies is ordinate, and the standard curve is established; the number of gene copies of dissimilatory sulfite reductase in the sample to be tested is calculated, that is, the content of sulfate reductant bacteria in the sample to be tested; the invention is a fast detection, low cost, strong specificity, high sensitivity and good repeatability. A broad-spectrum method for the detection of sulfate-reducing bacteria.

【技术实现步骤摘要】
定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物
本专利技术涉及微生物检测鉴定
，属于硫酸盐还原菌的快速分子检测领域，尤其涉及定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物。
技术介绍
硫酸盐还原菌是一类能够将硫酸盐异化成硫化物并且氧化各种生长底物的专性厌氧菌。在自然界中，但凡是厌氧的条件，都能拓生出硫酸盐还原菌的生态位，例如酸矿废水、蓝藻微生物垫、深海热液喷口、高盐微生物垫、海洋与淡水沉积物、海洋沉积物的沼气区、油田、厌氧净化植物、植物根系土壤、稻田等特定生态环境。迄今为止，人们记载过的硫酸盐还原菌已超60个属中的220个品种。在油田中，最常见的硫酸盐还原菌是脱硫弧菌(Desultphovbrio)和脱硫肠状菌(Desulphfotomaculum)。硫酸盐还原菌能够利用糖类、蛋白质、核酸和脂质几乎所有的降解产物，将硫酸盐离子最终变成H2S等有毒的硫化物，进而导致周围环境的腐蚀和酸化，尤其是针对储油罐、油气井、输油管道、油轮和冷却塔等水环境。比如说，硫酸盐还原菌会寄生在储油罐中，尤其在注水时，会形成大量的H2S，这会导致罐体酸化，进而引起腐蚀和脱离等安全问题。硫酸盐还原菌还能寄生在井身、输油管道等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测待测样品中硫酸盐还原菌含量的方法，包括如下步骤：1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；所述获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的方法包括如下步骤：1)‑a、制备标准品溶液：将含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒溶于水中，得到标准品溶液；1)‑b、检测所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数：先检测所述标准品溶液的OD260值，再按照如下公式1至公式3计算标准品溶液的质粒DNA拷贝数：标准品的浓度A(ng/μL)＝标准品溶液的OD260值×50(ng/μL)   (公式1)；标准品的摩尔质量B(g)＝标准品碱基数的对数×660(g)   (公式2)；...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测待测样品中硫酸盐还原菌含量的方法，包括如下步骤：1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；所述获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的方法包括如下步骤：1)-a、制备标准品溶液：将含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒溶于水中，得到标准品溶液；1)-b、检测所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数：先检测所述标准品溶液的OD260值，再按照如下公式1至公式3计算标准品溶液的质粒DNA拷贝数：标准品的浓度A(ng/μL)＝标准品溶液的OD260值×50(ng/μL)(公式1)；标准品的摩尔质量B(g)＝标准品碱基数的对数×660(g)(公式2)；标准品溶液的质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×标准品的浓度A×10-9(g/μL)/标准品的摩尔质量B(公式3)；1)-c、按照所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数进行梯度稀释，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；2)、用成套引物分别对所述稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，得到不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数和待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数；再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；再将所述待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数代入标准曲线，计算获得待测样品中异化型亚硫酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世仑，王大威，靖波，张健，王秀军，景宏，马挺，
申请(专利权)人：中国海洋石油集团有限公司，中海油研究总院有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11