用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法技术

本发明专利技术公开了基于PCR‑内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物，针对人β珠蛋白基因的核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA、以待测样本的DNA为模板，以MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物进行PCR扩增得到待测样本DNA扩增产物，并加入UNG酶防污染技术和内控分别用于避免假阳性和假阴性结果。将待测样本DNA扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。本发明专利技术基于PCR‑内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

Detection of Mycoplasma Pneumoniae by PCR-Internally Controlled Nucleic Acid Test Strip

The invention discloses a detection method for Mycoplasma pneumoniae based on PCR internally controlled nucleic acid test strip, which is carried out in the following steps: MP specific primers modified with digoxin and biotin are designed for the 16S rRNA nucleic acid sequence of Mycoplasma pneumoniae, and beta globin gene primers modified with digoxin and fluorescein Cy3 are designed for the nucleic acid sequence of human beta globin gene; DNA was amplified by PCR using MP specific primers and beta globin gene primers as templates. UNG enzyme anti-contamination technology and internal control were added to avoid false positive and false negative results, respectively. The DNA amplification products of the samples to be tested were detected with the internal control nucleic acid test strip of Mycoplasma pneumoniae. The method for detecting Mycoplasma pneumoniae based on the PCR internally controlled nucleic acid test paper has simple operation and can quickly detect Mycoplasma pneumoniae.

【技术实现步骤摘要】
用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法
本专利技术属于分子生物检测
，涉及一种基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)是引起呼吸道感染最常见的病原微生物之一，其目前发病率呈现出上升的趋势且可引起多系统病变。肺炎支原体缺乏细胞壁，使其对影响细胞壁合成的抗生素具有本质耐药性，临床上应选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物来治疗，如大环内醋类、喳诺酮类、氨基糖普类、四环素类等。由于大部分药物对儿童正常生长发育有不良反应，目前大环内酯类是首选药物。随着大环内酷类抗生素的广泛应用，肺炎支原体对该抗生素耐药性呈现出逐年升高趋势。肺炎支原体感染临床表现不具有特征性，容易和其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆，且常与其它病原菌发生混合感染，因此临床需要一种灵敏、快速、特异的检测方法来早期确诊肺炎支原体肺炎，以便及时、正确用药，减少并预防耐药性。目前肺炎支原体检测的方法主要有分离培养、血清学抗体检测和PCR诊断。但是肺炎支原体分离培养进行检测时需要耗费较长的时间，且培养条件苛刻，灵敏度不高，用于临床诊断意义不大；而目前进行血清科学抗体检测主要有两大类：一类是血清肺炎支原体抗体IgM或IgG检测，一类是肺炎支原体核酸(MP-DNA)检测。血清学检测简便快捷，在临床上得到了广泛的应用。但这种方法仅对既往感染能提供较好的检测指标，而对现症感染考核的应用价值较低，荧光定量PCR是MP-DNA检测中最常用的方法，但该方法操作复杂，且存在荧光探针、仪器价格昂贵等问题，许多基层临床单位尚不能开展。所以研究并开发用于MP检测关键技术和相关检测产品具有重大临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。本专利技术采用的技术方案是，基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：步骤1，针对肺炎支原体的16SrRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA；步骤2，以待测样本的DNA为模板，以MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；步骤3，将扩增产物使用肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条进行检测。本专利技术的特点还在于：MP特异性引物为：MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；β珠蛋白基因引物为：β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。步骤2中PCR扩增程序为：UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。进行PCR扩增时，按照体积分数，向PCR管加入10％的10×Taqbuffer、8％的dNTP(A:U:C:G)、1％的HotMasterTaqDNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的ddH2O。肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条包括PVC胶板，PVC胶板上表面上呈线性依次固接有上样垫、结合垫、层析膜和吸水纸；上样垫与结合垫部分贴合，结合垫与层析膜部分贴合，层析膜与吸水纸部分贴合；结合垫上喷涂有地高辛抗体包被的金磁纳米微粒，层析膜上嵌有检测线T、内控线IC和质控线C，检测线T上包被有链霉亲和素，内控线IC上包被有Cy3抗体，质控线C上包被有羊抗鼠IgG，检测线T靠近免疫金磁微粒标记的结合垫端，内控线IC位于检测线T和质控线C之间。上样垫和结合垫的材质均为亲水性的聚酯纤维，层析膜为硝酸纤维素薄膜。步骤3中具体按照下述方法进行：步骤3.1，将步骤2得到的待测样本DNA扩增产物滴加至上样垫上；步骤3.2，观察肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条上的检测线T、内控线IC和质控线C，若质控线C、内控线IC和检测线T均发生显色反应，则检测结果为阳性，说明待测样本中含有肺炎支原体靶片段；若质控线C、内控线IC显色而检测线T不显色，则说明待测样本中不含肺炎支原体靶片段；若仅质控线C显色而内控线IC、检测线T均不显色，则表明检测全过程中某一步或某几步出现问题，试纸条结果不可信，重新进行检测；若质控线不显色，则重新取肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条进行检测。本专利技术的有益效果是：本专利技术一种用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法，利用PCR对MP特异性靶基因进行识别和扩增，利用扩增片段标记的地高辛和生物素分别和金磁微粒表面的地高辛抗体和试纸条检测线上的链霉亲相互作用，结合侧向流技术，实现对MP目的基因的识别，并加入UNG酶防污染技术和内控分别用于避免假阳性和假阴性结果。在完成靶基因扩增后,直接将扩增产物点于上样垫，几分钟后即可用肉眼判，不需要任何昂贵检测仪器和复杂的操作过程。附图说明图1是肺炎支原体检测内控核酸试纸条结构示意图；图2是本专利技术基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法实施例1中检测结果图；图3是本专利技术基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法实施例2的检测结果图。图中，1.PVC胶板，2.上样垫，3.结合垫，4.层析膜，5.吸水纸，6.检测线T,7.内控线IC，8.质控线C。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：步骤1，针对肺炎支原体的16SrRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物：MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；针对人β珠蛋白基因的核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物：β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。提取待测样本的DNA；步骤2，以待测样本的DNA为模板，MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，具体按照下述方法进行：步骤2.1，向PCR管加入10％的10×Taqbuffer、8％的dNTP(A:U:C:G)、1％的HotMasterTaqDNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的ddH2O；步骤2.2，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min；步骤3，将步骤2得到的待测样本DNA扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测：其中，如图1所示，内控核酸试纸条包括PVC胶板本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于PCR‑内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA；步骤2，以待测样本的DNA为模板，以所述MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；步骤3，将所述扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。

【技术特征摘要】
1.基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：步骤1，针对肺炎支原体的16SrRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA；步骤2，以待测样本的DNA为模板，以所述MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；步骤3，将所述扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。2.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述MP特异性引物为：MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；所述β珠蛋白基因引物为：β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。3.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增程序为：UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。4.根据权利要求3所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，进行PCR扩增时，按照体积分数，向PCR管加入10％的10×Taqbuffer、8％的dNTP(A:U:C:G)、1％的HotMasterTaqDNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的ddH2O。5.根据权利要求1所述的基于PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：廉婷，陈程，姚杨，邱忠营，李慧瑾，李银未，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61