用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法技术

本发明专利技术公开了基于PCR‑内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物，针对人β珠蛋白基因的核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA、以待测样本的DNA为模板，以MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物进行PCR扩增得到待测样本DNA扩增产物，并加入UNG酶防污染技术和内控分别用于避免假阳性和假阴性结果。将待测样本DNA扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。本发明专利技术基于PCR‑内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

Detection of Mycoplasma Pneumoniae by PCR-Internally Controlled Nucleic Acid Test Strip

The invention discloses a detection method for Mycoplasma pneumoniae based on PCR internally controlled nucleic acid test strip, which is carried out in the following steps: MP specific primers modified with digoxin and biotin are designed for the 16S rRNA nucleic acid sequence of Mycoplasma pneumoniae, and beta globin gene primers modified with digoxin and fluorescein Cy3 are designed for the nucleic acid sequence of human beta globin gene; DNA was amplified by PCR using MP specific primers and beta globin gene primers as templates. UNG enzyme anti-contamination technology and internal control were added to avoid false positive and false negative results, respectively. The DNA amplification products of the samples to be tested were detected with the internal control nucleic acid test strip of Mycoplasma pneumoniae. The method for detecting Mycoplasma pneumoniae based on the PCR internally controlled nucleic acid test paper has simple operation and can quickly detect Mycoplasma pneumoniae.

【技术实现步骤摘要】
用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法
本专利技术属于分子生物检测
，涉及一种基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)是引起呼吸道感染最常见的病原微生物之一，其目前发病率呈现出上升的趋势且可引起多系统病变。肺炎支原体缺乏细胞壁，使其对影响细胞壁合成的抗生素具有本质耐药性，临床上应选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物来治疗，如大环内醋类、喳诺酮类、氨基糖普类、四环素类等。由于大部分药物对儿童正常生长发育有不良反应，目前大环内酯类是首选药物。随着大环内酷类抗生素的广泛应用，肺炎支原体对该抗生素耐药性呈现出逐年升高趋势。肺炎支原体感染临床表现不具有特征性，容易和其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆，且常与其它病原菌发生混合感染，因此临床需要一种灵敏、快速、特异的检测方法来早期确诊肺炎支原体肺炎，以便及时、正确用药，减少并预防耐药性。目前肺炎支原体检测的方法主要有分离培养、血清学抗体检测和PCR诊断。但是肺炎支原体分离培养进行检测时需要耗费较长的时间，且培养条件苛刻，灵敏度不高，用于临床诊断意义本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于PCR‑内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA；步骤2，以待测样本的DNA为模板，以所述MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；步骤3，将所述扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。

【技术特征摘要】
1.基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：步骤1，针对肺炎支原体的16SrRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA；步骤2，以待测样本的DNA为模板，以所述MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；步骤3，将所述扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。2.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述MP特异性引物为：MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；所述β珠蛋白基因引物为：β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。3.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增程序为：UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。4.根据权利要求3所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，进行PCR扩增时，按照体积分数，向PCR管加入10％的10×Taqbuffer、8％的dNTP(A:U:C:G)、1％的HotMasterTaqDNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的ddH2O。5.根据权利要求1所述的基于PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：廉婷，陈程，姚杨，邱忠营，李慧瑾，李银未，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61