一种解析植物内生细菌菌群的方法技术

本发明专利技术公开了一种解析植物内生细菌菌群的方法。本发明专利技术提供了用于解析植物内生细菌菌群的引物对，其靶序列为细菌16SrDNA的V3‑V4区的全长或部分；且所述引物对中的一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16S rDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。本发明专利技术设计了一对引物322F‑1和796R，选择了具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶，共同实现了同时避开宿主植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA两种序列污染的目的，从而获得了纯的细菌菌群16S扩增子文库。

A METHOD FOR DETERMINING ENDOGENOUS BACTERIAL FLORA IN PLANTS

The invention discloses a method for analysing endophytic bacterial flora in plants. The present invention provides a pair of primers for the analysis of endophytic bacterial flora, whose target sequence is the full length or part of the V3 V4 region of bacterial 16SrDNA, and the last base of one primer 3'terminal in the pair is different from that of plant mitochondrial 18SrDNA, and the difference between the full length of the primer and plant mitochondrial 18SrDNA is greater than or equal to three; the last base of the other primer 3' terminal is different from that of plant mitochondrial 18SrDNA. The 16S rDNA of base and plant chloroplast was different, and the difference between the full length of the primer and 18S rDNA of plant mitochondria was greater than or equal to 3. A pair of primers 322F_1 and 796R were designed. DNA polymerase with thermal activation activity and without 3'5'exonuclease correction activity was selected. The purpose of avoiding the contamination of both host plant chloroplast 16S rDNA and mitochondrial 18S rDNA sequences was achieved, and a pure bacterial 16S amplification sublibrary was obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种解析植物内生细菌菌群的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种解析植物内生细菌菌群的方法，特别涉及一种利用引物对322F-1/796R解析植物内生细菌菌群结构的方法。
技术介绍
自然条件下，植物的诸多器官内外都定殖着大量的复杂多样的微小生物，包括细菌、真菌、古菌、原生动物等等，它们影响着植物的生长发育和健康状态。在这些微小生物中，细菌在数量上占绝对优势，按照这些细菌定殖在植物组织的表面或者内部，它们被分为两类，分别叫做植物表面菌群和植物内生菌群。植物内生菌的研究方法有培养法和非培养法两类，借助于16SrDNA扩增子测序的二代测序是是非培养法中经典研究方法，也是目前应用最普遍的一种方法。细菌的16SrDNA由10个序列保守区和9个序列高变区交替排列组成，保守区序列在不同的细菌中几乎是一致的，而高变区则具有物种特异性，因此，16SrDNA是公认的细菌分类鉴定的分子钟。应用上，可以根据16SrDNA的的序列保守区设计一对引物，扩增出含有几个高变区的序列片段，然后根据高变区的序列特异性进行菌种的分类鉴定。基于此原理，借助于16SrDNA扩增子测序的二代测序被发展起来，并广泛应用与动植物菌群的多样性解析。对于植物内生菌群的解析，由于植物的叶绿体16SrDNA和线粒体18SrDNA与细菌的16SrDNA有很高的同源性，导致16S扩增子文库中会出现极高比例的宿主DNA污染，严重干扰后续的多样性分析。目前，为了实现通过16S扩增子测序方法解析植物内生菌群的目的，急需设计合适的扩增引物及可行的扩增方案来避开宿主植物DNA的污染从而获得纯的菌群16S扩增子，从而为植物内生菌群的解析提供测序实验平台。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于解析植物内生细菌菌群的引物对。本专利技术提供的引物对，其靶序列为细菌16SrDNA的V3-V4区的全长或部分(与细菌16SrDNA完全相同)；且所述引物对中的一条引物与植物线粒体18SrDNA中区域甲对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域甲中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域甲的差异位点大于等于3个；所述区域甲与所述一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均相同或互补；所述引物对中的另一条引物与植物叶绿体16SrDNA中区域乙对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域乙中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域乙的差异位点大于等于3个；所述区域乙与所述另一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均互补或相同。且所述引物对中的一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。上述引物对中，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列1；所述引物2的核苷酸序列为序列2。上述中，引物1和引物2的一端均可添加区分不同样本的Barcode序列。上述的引物对中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。本专利技术另一个目的是提供用于解析植物内生细菌菌群的试剂。本专利技术提供的试剂，包括上述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶。本专利技术第3个目的是提供用于解析植物内生细菌菌群的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述引物对或上述的试剂。上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在解析植物内生细菌菌群中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在制备解析植物内生细菌菌群产品中的应用也是本专利技术保护的范围。上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在避开植物宿主DNA污染且获得植物内生细菌菌群16S扩增子中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在构建植物内生菌群测序文库中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在植物内生菌群测序中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术第4个目的是提供一种解析植物内生细菌菌群的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)提取待测植物组织基因组DNA，用上述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶扩增，得到PCR扩增产；2)对所述PCR产物进行测序，根据测序结果鉴定待测植物组织内生细菌菌群，从而解析植物叶际内生细菌菌群结构。上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；所述双子叶植物具体为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。本专利技术的实验证明，本专利技术设计了一对引物322F-1和796R，优化了PCR扩增方案——选择了具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶，两个引物的组合及PlatinumTaqDNApolymerase的特性共同实现了同时避开宿主植物叶绿体16SrDNA和线粒体18SrDNA两种序列污染的目的，从而获得了纯的细菌菌群16S扩增子文库，使后续的菌群大数据多样性分析成为可能；结合Illumina二代测序平台建立了适用于多种植物内生菌群解析的测序实验平台。附图说明图1为本专利技术的引物对及扩增方案的扩增产物凝胶电泳图。图2为实施例3高通量测序实验中4个样品的样品稀释曲线图。图3为实施例3高通量测序实验中4个样品的两个alpha多样性指数柱形图。图4为实施例3高通量测序实验中4个样品的门水平相对丰度柱形图。图5为实施例3高通量测序实验中4个样品的属水平相对丰度柱形图。图6为引物322F-1与多种植物线粒体18SrDNA的比对结果。图7为引物796R与多种植物叶绿体16SrDNA的比对结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、解析植物内生细菌菌群的引物设计及合成本专利技术设计避开宿主植物叶绿体16SrDNA和线粒体18SrDNA，根据细菌16SrDNA的V3-V4区设计引物对如下：一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。根据上述设计原则设计合成如下引物对：322F-1：5’ACGGHCCARACTCCTACGGAA3’(序列1)796R：5’CTACCMGGGTATCTAATCCKG3’(序列2)；实施例2、解析植物内生细菌菌群的方法的建立一、PCR扩增以2016年9月12日采于福建农林大学水稻试验田健康水稻叶片的总DNA为模板，用实施例1的引物322F‐1和796R，以及具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶PlatinumTaqDNApolymerase(Invitrogen，USA)，进行PCR扩增。上述PCR扩增的反应体系如下：上述反应体系中，各个引物的终浓度为终浓度为0.2μM；Taq酶的终浓度为2U/rxn；MgCl2的终浓度为1.5mM。上述PCR反应程序如下：结果如图1所示，Marker：DNAMarkerⅡ(TI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于解析植物内生细菌菌群的引物对，其靶序列为细菌16S rDNA的V3‑V4区的全长或部分；且所述引物对中的一条引物与植物线粒体18S rDNA中区域甲对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域甲中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域甲的差异位点大于等于3个；所述区域甲与所述一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均相同或互补；所述引物对中的另一条引物与植物叶绿体16S rDNA中区域乙对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域乙中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域乙的差异位点大于等于3个；所述区域乙与所述另一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均互补或相同。

【技术特征摘要】
1.用于解析植物内生细菌菌群的引物对，其靶序列为细菌16SrDNA的V3-V4区的全长或部分；且所述引物对中的一条引物与植物线粒体18SrDNA中区域甲对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域甲中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域甲的差异位点大于等于3个；所述区域甲与所述一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均相同或互补；所述引物对中的另一条引物与植物叶绿体16SrDNA中区域乙对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域乙中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域乙的差异位点大于等于3个；所述区域乙与所述另一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均互补或相同。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列1；所述引物2的核苷酸序列为序列2。3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。4.用于解析植物内生细菌菌群的试剂，包括权利要求1-3中任一所述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶。5.用于解析植物内生细菌菌群的试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂。6.权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒在解析植物内生细菌菌群中的应用；或权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莉莉，陈丽莹，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11