产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒技术

本发明专利技术公开了产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明专利技术提供了用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增的成套反应引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB组成；所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB对应的核酸序列分别为序列表中的序列1至序列6。本发明专利技术引物可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测产酸克雷伯杆菌，不需要复杂仪器，为产酸克雷伯杆菌的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和疾病预防控制中心筛查和检测产酸克雷伯杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Isothermal Amplification Detection of Klebsiella Acidogenicum and Its Primers and Kits

The invention discloses a constant temperature amplification detection method for Klebsiella acidogenicus and a special primer and kit thereof. The present invention provides a set of reaction primers for detecting RING-mediated isothermal amplification of Klebsiella acidogenicus, which consists of primers F3, primer B3, primer FIP, primer BIP, primer LoopF and primer LoopB; the corresponding nucleic acid sequences of the primers F3, primer B3, primer FIP, primer BIP, primer LoopF and primer LoopB are sequence 1 to sequence 6 in the sequence table, respectively. The primers of the invention can detect Klebsiella acidogenicus rapidly, conveniently, efficiently, highly specific and highly sensitive under isothermal conditions without complex instruments, and provide a new technical platform for the detection of Klebsiella acidogenicus. The primers can be used for screening and detecting Klebsiella acidogenicus in primary medical and health units and centers for disease prevention and control. The primers have broad market prospects and larger economy. Economic and social benefits, suitable for a wide range of promotion and application.

【技术实现步骤摘要】
产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒。
技术介绍
克雷伯杆菌是社区感染和医院感染重要的病原菌，尤其在免疫缺陷患者和ICU重症患者可以引起严重的肺部感染和血流感染，具有很高的发病率和死亡率。克雷伯杆菌属主要包括肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、解鸟氨酸克雷伯杆菌、植生克雷伯杆菌和土生克雷伯杆菌5个菌种，其中肺炎克雷伯杆菌和产酸克雷伯杆菌是引起人肺部感染和血流感染的重要病原体。除了引起肺部感染和血流感染，产酸克雷伯杆菌也是食物中毒和抗生素相关出血性结肠炎的重要病原体。新英格兰杂志有研究证明产酸克雷伯杆菌是非难辨梭菌导致的抗生素相关出血性结肠炎的主要病原菌。产酸克雷伯杆菌可以分泌细胞毒素，具有很强的毒力和很高的致病性，有研究证实在小鼠腹腔注射产酸克雷伯杆菌后，实验小鼠在24h全部因感染死亡。传统的产酸克雷伯杆菌的检测方法，包括乳酸菌降解分析实验、松三糖利用实验、API鉴定法以及VITEK2细菌自动鉴定法等，通常基于表型检测，因此很难将产酸克雷伯杆菌同肺炎克雷伯杆菌等其他克雷伯杆菌属的细菌相鉴别。目前常用的分子基因分型方法,如脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性DNA分析和扩增片段长度多态性分析等，对实验设备及操作人员具有很高的要求，不适于基层医疗机构推广。因此,目前亟需建立一种快速、简便、经济、高效、特异的产酸克雷伯杆菌检测方法。环介导等温扩增法(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)是一种新型恒温DNA快速扩增技术，在BstDNA聚合酶作用下，65℃恒温实现对靶基因序列的高效、快速、特异性特的扩增。较于传统的PCR技术，LAMP对实验设备要求低，只需要一个普通水浴锅即能满足要求，而且加入显色剂后，反应结果肉眼可见，可以用于感染性疾病的快速诊断以及细菌、病毒和寄生虫等感染病原体的流行病学监测。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增的成套反应引物。本专利技术提供的成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LoopF如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LoopB如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。上述引物中，所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LoopF和所述引物LoopB的摩尔比为1:1:8:8:4:4。本专利技术另一个目的是提供用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增反应试剂。本专利技术提供的反应试剂，包括上述成套引物。上述试剂还包括DNA聚合酶、dNTP、Tris-HCl、MgSO4、KCl、(NH4)2SO4、甜菜碱和Tween-20。上述环介导等温扩增反应试剂由DNA聚合酶、dNTP、Tris-HCl、MgSO4、KCl、(NH4)2SO4、甜菜碱、Tween-20和上述的引物和水组成。所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LoopF和所述引物LoopB的浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、0.8μM和0.8μM。本专利技术第三个目的是提供用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，其包括上述的引物或上述的环介等温扩增试剂。为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为产酸克雷伯杆菌标准菌株K.oxytocaATCC700324的DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如双蒸水)。具体的，该产酸克雷伯杆菌的LAMP检测试剂盒分为实时浊度法检测试剂盒和calcein/Mn2+荧光显色法检测试剂盒2种。实时浊度法LAMP检测试剂盒检测试剂体积为25μl，由1.4mMdNTP，20mMTris-HCl(pH8.8)，8mMMgSO4，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.8M甜菜碱,0.1％Tween-20，8UBstDNA聚合酶，0.2μM正向外引物KO-16F3，0.2μM反向外引物KO-16B3，1.6μM正向内引物KO-16FIP，1.6μM反向内引物KO-16BIP,0.8μM正向环引物KO-16LoopF，0.8μM反向环引物KO-16LoopB和水组成。calcein/Mn2+荧光显色法试剂盒在实时浊度法试剂盒的反应体系基础上加入1μl的calcein/Mn2+荧光指示剂,calcein/Mn2+荧光指示剂由1.3mMcalcein和26mMMnCl2溶于70％(体积百分含量)二甲亚砜配制而成。calcein/Mn2+荧光显色法LAMP检测试剂盒检测试剂体积为26μl，由1.4mMdNTP，20mMTris-HCl(pH8.8)，8mMMgSO4，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.8M甜菜碱,0.1％Tween-20，8UBstDNA聚合酶，0.2μM正向外引物KO-16F3，0.2μM反向外引物KO-16B3，1.6μM正向内引物KO-16FIP，1.6μM反向内引物KO-16BIP,0.8μM正向环引物KO-16LoopF，0.8μM反向环引物KO-16LoopB，1μl的calcein/Mn2+荧光指示剂和水组成。上述成套引物或上述PCR试剂在如下1)或2)或3)中的应用也是本专利技术保护的范围：1)制备鉴定或辅助鉴定产酸克雷伯杆菌的产品；2)制备检测待测样本中是否含有产酸克雷伯杆菌的产品。3)制备检测或辅助检测待测菌是否为产酸克雷伯杆菌的产品。上述应用中，所述产品为试剂盒。本专利技术第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定产酸克雷伯杆菌的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增；用如下A或B判断：A、用浊度仪检测扩增产物，若扩增产物浊度呈S曲线变化，则所述待测微生物为或候选为产酸克雷伯杆菌；若扩增产物浊度未发生变化，则所述待测微生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定或辅助鉴定产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LoopF如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LoopB如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定或辅助鉴定产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物LoopF如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物LoopB如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LoopF和所述引物LoopB的摩尔比为1:1:8:8:4:4。3.一种鉴定或辅助鉴定产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增试剂，其包括权利要求1或2所述的成套引物。4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：所述试剂还包括DNA聚合酶、dNTP、Tris-HCl、MgSO4、KCl、(NH4)2SO4、甜菜碱和Tween-20。5.根据权利要求4所述的PCR试剂，其特征在于：所述试剂还包括荧光指示剂；和/或，所述荧光指示剂具体包括calcein和MnCl2。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵进，董德荣，刘运喜，张波，刘一，董志伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军特色医学中心，中国人民解放军疾病预防控制中心，中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11