一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒包括序列表中序列1‑296所示的296条单链DNA。本发明专利技术提供的细菌耐药基因检测方法包括如下步骤：(1)提取待测细菌的基因组DNA，利用成套单链DNA对所述基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；(2)基于Ampliseq技术利用所述扩增产物构建测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，得到测序结果，并将所述测序结果与耐药基因序列进行比对，确定待测细菌是否携带耐药基因。本发明专利技术的检测方法和试剂盒可高通量、快速、准确的同时检测待测样本的多个耐药基因，具有良好应用前景。

A Detection Method of Bacterial Drug Resistance Genes and Its Special Kit

The invention discloses a method for detecting bacterial resistance genes and a special kit thereof. The kit provided by the invention comprises 296 single-stranded DNA shown in sequence 1 296 in sequence list. The method for detecting bacterial resistance genes provided by the invention comprises the following steps: (1) extracting genomic DNA of the bacteria to be tested, amplifying the genomic DNA by using a set of single-stranded DNA, and obtaining the amplified products; (2) constructing a sequencing Library Based on the amplified products by using the ampiseq technology; (3) sequencing the sequencing library to obtain the sequencing results, and then sequencing results and drug resistance. Gene sequences were aligned to determine whether the bacteria tested carried resistance genes. The detection method and kit of the invention can simultaneously detect multiple drug resistance genes of the tested samples with high throughput, rapidity and accuracy, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒。
技术介绍
细菌耐药基因检测在临床诊断中具有重要意义。现阶段应用较广的商业化细菌耐药基因检测方法主要包括以下四种：自动检测系统的Vitek2，飞行质谱MALDI-TOF，快速的生化检测以及实时影像监测。Vitek2进行临床样本检测时表现出较好的一致性，但是其检测样本需为阳性培养物，而一般血液样本报告阳性时间需要至少24小时，极大延误了治疗时机。实时影像监测也存在相同问题。飞行质谱以及生化检测只能确定产碳青霉烯酶以及beta内酰胺酶的病原体，对于其他耐药性的细菌很难进行准确检测。除此之外，以聚合酶链式反应为基础的细菌耐药性检测方法也应用较广，如Proveit，FilmArray，Verigene等，但是这些方法只能检测几种常见的耐药基因，存在一定局限性。Ampliseq技术是指在测序的过程中特异性的扩增靶标片段，最后对该片段进行测序确定碱基组成的方法。与传统的二代测序方法不同，该方法不采用超声的方式将基因组打断为短片段，而是在同一反应体系内，预先放置引物，利用引物特异性的扩增感兴趣的目标片段，从而产生符合后续测序读长的短片段。该方法能够在同一反应条件下，同一反应体系内，放置多达24000对引物，对目标片段进行扩增。目前Ampliseq技术已被广泛应用到人常见疾病的筛查当中，如癌症的筛查、遗传疾病的筛查。在病原诊断方面，该技术被应用到Ebola病毒的诊断以及结核分枝杆菌的耐药基因的诊断。Ampliseq技术在多方面的诊断中表现出优异的鉴定能力以及突变位点的识别能力，在多重检测中表现出较强的优势。该技术已成为国内外疾病筛查、病原筛查和耐药筛查的主要技术方法。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供成套单链DNA。本专利技术提供的成套单链DNA由序列表中序列1-296所示的296条单链DNA组成。本专利技术的第二个目的是提供上述成套单链DNA的新用途。本专利技术提供了上述成套单链DNA在如下a1)-a6)中任一种中的应用：a1)检测或辅助检测细菌耐药基因；a2)制备检测或辅助检测细菌耐药基因的产品；a3)检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类；a4)制备检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类的产品；a5)检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌；a6)制备检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌的产品。本专利技术的第三个目的是提供用于检测细菌耐药基因的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒包括上述成套单链DNA。所述试剂盒的功能为如下1)或2)或3)：1)检测或辅助检测细菌耐药基因；2)检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类；3)检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌。所述试剂盒还可包括构建文库所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂、制备测序模板所需试剂和/或进行测序所需试剂。所述构建文库所需的试剂可为IonAmpliseqLibraryKit2.0(ThermoFisher公司，编号No.4480441)中试剂。所述制备测序模板所需试剂可为IonPGMOT2200TemplateKit(ThermoFisher公司，编号No.448094)中试剂。所述进行测序所需试剂可为IonPITMHi-QTMSequencing200Kit(ThermoFisher公司，编号No.26433)中试剂。本专利技术的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类的方法。本专利技术提供的检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因的种类的方法包括如下步骤：(1)提取待测细菌的基因组DNA，利用上述成套单链DNA对所述基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；(2)基于Ampliseq技术利用所述扩增产物构建测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，得到测序结果，并将所述测序结果与耐药基因序列进行比对，确定待测细菌是否携带耐药基因及携带耐药基因的种类。上述应用或试剂盒或方法中，所述耐药基因为如下至少一种：aac(2’)-lb、aadA1、aadA3、aadB、aadD、adeb、ant(4’-llb)、aph3-la、armA、blaZ、catB3、catB6、catB8、cmlA5、CTX-M-14、dfrA19、dfrG、E.coli_gyrA、E_coli_parC、IMP-1、KPC-1、mecA、mecC、mcr-1、mtrC、mtrD、mtrE、mtrR、NDM-1、oprD、oqxA、oqxB、blaOXA-10、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-1、blaOXA-51、blaOXA-58、blaOXA-66、blaOXA-69、blaOXA-82、PAO_gyrA_parC、patA、patB、pbp1a、pbp2b、pbp2x、phoP、phoQ、pmrA、pmrB、qacA、qnrA1、qnrB4、rpsJ、sat-1、blaSHV-60、strA、strB、sul1、blaTEM-12、tetA、tetD、tetM、tetR、vanA、vanB、VIM-2。所述细菌为如下至少一种：鲍曼不动杆菌Acinetobacterbaumannii、粪肠球菌Enterococcusfaecalis、屎肠球菌Enterococcusfaecium、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、带beta-内酰胺耐药的肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniaewithbeta-lactamase、万古霉素耐药的肠球菌vancomycin-resistantEnterococci、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis、溶血葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus、人葡萄球菌Staphylococcushominis、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌methicillin-resistantStaphylococcusaureus。所述待测样品可为血液样品。本专利技术提供了一种细菌耐药基因的检测方法及其专用试剂盒。本专利技术提供的试剂盒包括序列表中序列1-296所示的296条单链DNA。本专利技术提供的细菌耐药基因检测方法包括如下步骤：(1)提取待测细菌的基因组DNA，利用成套单链DNA对所述基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；(2)基于Ampliseq技术利用所述扩增产物构建测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，得到测序结果，并将所述测序结果与耐药基因序列进行比对，确定待测细菌是否携带耐药基因及携带耐药基因的种类。本专利技术的检测方法在一次反应中，可高通量、快速、准确的同时检测待测样本的68个耐药基因，推测其耐药表型，为临床准确用药提供指导性作用，减少抗生素滥用以及因此产生的超级细菌，具有良好应用前景。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成套单链DNA，由序列表中序列1‑296所示的296条单链DNA组成。

【技术特征摘要】
1.成套单链DNA，由序列表中序列1-296所示的296条单链DNA组成。2.权利要求1所述的成套单链DNA在检测或辅助检测细菌耐药基因中的应用；或，权利要求1所述的成套单链DNA在制备检测或辅助检测细菌耐药基因的产品中的应用。3.权利要求1所述的成套单链DNA在检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因种类中的应用；或，权利要求1所述的成套单链DNA在制备检测或辅助检测待测细菌是否携带耐药基因和/或携带耐药基因种类的产品中的应用。4.权利要求1所述的成套单链DNA在检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌中的应用；或，权利要求1所述的成套单链DNA在制备检测或辅助检测待测样品是否含有携带耐药基因的细菌的产品中的应用。5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述耐药基因为如下至少一种：aac(2’)-lb、aadA1、aadA3、aadB、aadD、adeb、ant(4’-llb)、aph3-la、armA、blaZ、catB3、catB6、catB8、cmlA5、CTX-M-14、dfrA19、dfrG、E.coli_gyrA、E_coli_parC、IMP-1、KPC-1、mecA、mecC、mcr-1、mtrC、mtrD、mtrE、mtrR、NDM-1、oprD、oqxA、oqxB、blaOXA-10、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-1、blaOXA-51、blaOXA-58、blaOXA-66、blaOXA-69、blaOXA-82、PAO_gyrA_parC、patA、patB、pbp1a、pbp2b、pbp2x、phoP、phoQ、pmrA、pmrB、qacA、qnrA1、qnrB4、rpsJ、sat-1、blaSHV-60、strA、strB、sul1、blaTEM-12、tetA、tetD、tetM、tetR、vanA、vanB、VIM-2。6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于：所述细菌为如下至少一种：鲍曼不动杆菌Acinetobacterbaumannii、粪肠球菌Enterococcusfaecalis、屎肠球菌Enterococcusfaecium、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、带beta-内酰胺耐药的肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniaewithbeta-lactamase、万古霉素耐药的肠球菌vancomycin-resistantEnterococci、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis、溶血葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus、人葡萄球菌Staphylococcushominis、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌methicillin-resistantStaphylococcusaureus。7.一种试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏，李倩，姜永强，律清宇，江华，郑玉玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11