双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。利用本发明专利技术的引物对样品进行检测，可实现一次性同时特异性检测样本中的无乳链球菌和海豚链球菌。本发明专利技术建立的检测方法可检测到基因组含量分别为9.84×10

Primers for Early Rapid Detection of Streptococcus agalactiae and Streptococcus dolphini by Dual-PCR and Their Application

The invention discloses a primer for early rapid detection of Streptococcus agalactiae and Streptococcus dolphinis by dual PCR and its application. By using the primers of the invention to detect the samples, it is possible to simultaneously and specifically detect Streptococcus agalactiae and Streptococcus dolphinis in the samples at one time. The detection method established by the invention can detect the genome content of 9.84*10, respectively.

【技术实现步骤摘要】
双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。
技术介绍
罗非鱼是世界范围内广泛养殖的水产品之一，据不完全统计，2014年，中国罗非鱼养殖产量达到169.85万吨，占全球养殖总产量的32％左右。近年来，罗非鱼链球菌病日益严重，已给罗非鱼养殖业造成严重的经济损失。研究表明罗非鱼链球菌病的主要致病菌是无乳链球菌和海豚链球菌，近几年危害最严重的是无乳链球菌病，无乳链球菌是一种人、畜和鱼共患的致病菌，其能感染海鲷、罗非鱼等多种海淡水鱼类发病，造成较高的死亡率。海豚链球菌同样是一种能引起鱼类发生感染和死亡的病原菌。海豚链球菌、无乳链球菌均能引起鱼类的败血症、脑膜炎等病症，从外部症状和两种病原菌的菌落、菌体形态上都很难准确判断是由哪一种链球菌引起的，这将严重影响到对病害的有效处理。目前罗非鱼链球菌的常规诊断方法都很难满足对感染鱼样本快速诊断的要求，同时一些生理反应现象可能随外界环境的变化而改变，也极易导致误判情况的发生。普通PCR一次仅能检测1个基因，可能会造成漏检或误检。荧光抗体技术和ELISA费用昂贵且较需要熟练的技术操作；LAMP则存在假阳性现象；定量PCR则需要昂贵的仪器、专业的操作以及存在成本高等不足。因此，要达到对患病鱼的快速诊断，需要建立高度特异、敏感、快速的罗非鱼链球菌早期分子诊断技术。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物。本专利技术的另一目的在于提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供上述引物或试剂盒的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法。本专利技术利用无乳链球菌和海豚链球菌的特异性鉴别基因，分别设计了特异性引物，采用双重PCR技术对两种链球菌进行快速检测。通过对双重PCR检测体系的优化，开发了针对无乳链球菌和海豚链球菌双重PCR检测技术的试剂盒，同时，建立了检测准确，高效的检测方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，包括如下引物序列：针对无乳链球菌16SrDNA基因的PCR引物：P-1：5'-ATACCGCATAAGAGTGATT-3'；P-2：5'-ACCACCTGTCACTTCTGCT-3'；针对海豚链球菌Sip基因的PCR引物：P-3：5'-TGAATAAGAAATTGTTTTTAGCG-3'；P-4：5'-ACTTGTAATCGTTGGTTCTGCC-3'。本专利技术提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒，包括上述引物P-1、P-2、P-3和P-4。所述的试剂盒，还包括PCR反应试剂。本专利技术提供上述引物或试剂盒在非疾病诊断中鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。本专利技术还提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法，包括如下步骤：所述的方法为非疾病诊断方法；(1)取待检样品；(2)加入含有上述引物P-1、P-2、P-3和P-4的反应混合液和待检样品，配成双重PCR反应体系混合液；进行双重PCR反应于一个反应程序；(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测检测液是否出现特异的DNA条带，出现则判定为阳性，阳性表示待检样品中含有无乳链球菌或/和海豚链球菌；没有出现特异性条带的则判定为阴性，阴性表示不含有无乳链球菌和海豚链球菌；其中，出现870bp片段的为无乳链球菌，出现614bp片段的则为海豚链球菌。所述的双重PCR反应体系为：1μL的待检样品，各2μM的引物P-1、P-2、各1.6μM的引物P-3、P-4，10×buffer(无Mg2+)缓冲液2.5μL，1.5mM的MgCl2，2.5mM的dNTP，0.5U的rTaqDNAPolymerase，DEPC补充至25μL。所述的双重PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30sec，54℃30sec和72℃30sec的30个循环，最后72℃延伸10min；所述的待检样品包括但不限于无乳链球菌和海豚链球菌的基因组DNA、菌落和含有无乳链球菌和海豚链球菌的组织样品；所述的待检样品还可以为鱼的血液、脑、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉。无乳链球菌与海豚链球菌的16SrDNA基因的同源性达到96.6％～96.8％，同源性较高，可在变异区设计特异性引物对其进行区分和鉴定。表面免疫源性蛋白Sip(Surfaceimmunogenicprotein，Sip)属于编码B群链球菌的表面蛋白基因类群，在不同种的血清型菌株中都有存在。本专利技术拟选用Sip基因和16SrDNA基因部分序列，通过引物组合优化建立一种快速、高效、稳定、特异性好、灵敏度高的无乳链球菌和海豚链球菌双重PCR检测方法，旨在为无乳链球菌和海豚链球菌的快速检测和早期预警提供一种准确、高效的检测技术，为链球菌病的准确诊断、检疫提供理论依据。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术最短在1.5h内即可完成所有检测操作，简单快速，解决了现有技术检测无乳链球菌和海豚链球菌存在的周期长、操作复杂、检测成本高等问题；(2)检测成本低，只需两对引物，操作简便，适合多样本的同时检测；(3)检测所需样品量少，仅需取少量鱼血或组织即可进行检测。(4)本专利技术还可以用于水体中无乳链球菌和海豚链球菌的检测及鉴定。(5)本专利技术所用的两对特异性引物，是根据无乳链球菌的16SrDNA基因和海豚链球菌的Sip基因序列设计的。按照本专利技术的方法可实现一次性同时特异性检测样本中的无乳链球菌和海豚链球菌，对无乳链球菌、海豚链球菌、无乳链球菌和海豚链球菌混合物可分别扩增出870bp、614bp、870bp和614bp的特异性条带。对6株鱼体常见病原菌和一株大肠杆菌进行特异性分析，仅无乳链球菌和海豚链球菌能分别扩增出16SrDNA和Sip两条特异性条带，其他7株菌无特异性片段。本专利技术建立的检测方法可检测到基因组含量分别为9.84×10-5ng/μL的无乳链球菌和9.30×10-5ng/μL的海豚链球菌，以及菌液浓度为2.76×102cfu/mL的无乳链球菌和2.51×102cfu/mL的海豚链球菌；用所建立的双重PCR检测方法对人工同时感染无乳链球菌和海豚链球菌的罗非鱼的肾脏进行PCR检测，可获得870、614bp的特异性片段，检出率100％。本方法在罗非鱼样品检测过程中快速准确具有较高的特异性、灵敏度、重复性和稳定性，可实现罗非鱼链球菌病的早期分子预警，应用前景广阔，为罗非鱼链球菌病的快速诊断、流行病学调查等提供了准确而有效的手段。附图说明图1是双重PCR检测无乳链球菌和海豚链球菌的特异性琼脂糖凝胶电泳；其中，M代表DNA2000bp大小标记；泳道1和泳道2分别代表了无乳链球菌ATCC13813和海豚链球菌ATCC29178参考菌株，泳道3同时含有这两个细菌；泳道4～10分别为嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌的基因组DNA。图2是特异引物对无乳链球菌和海豚链球菌的DNA灵敏度；其中，M代表DNA2000bp大小marker本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，其特征在于包括如下引物序列：针对无乳链球菌16S rDNA基因的PCR引物：P‑1：5'‑ATACCGCATAAGAGTGATT‑3'；P‑2：5'‑ACCACCTGTCACTTCTGCT‑3'；针对海豚链球菌Sip基因的PCR引物：P‑3：5'‑TGAATAAGAAATTGTTTTTAGCG‑3'；P‑4：5'‑ACTTGTAATCGTTGGTTCTGCC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，其特征在于包括如下引物序列：针对无乳链球菌16SrDNA基因的PCR引物：P-1：5'-ATACCGCATAAGAGTGATT-3'；P-2：5'-ACCACCTGTCACTTCTGCT-3'；针对海豚链球菌Sip基因的PCR引物：P-3：5'-TGAATAAGAAATTGTTTTTAGCG-3'；P-4：5'-ACTTGTAATCGTTGGTTCTGCC-3'。2.权利要求1所述的双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物在非疾病诊断中鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。3.一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物P-1、P-2、P-3和P-4。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR反应试剂。5.权利要求3或4所述的试剂盒在非疾病诊断中鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。6.一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：所述的方法为非疾病诊断方法；(1)取待检样品；(2)加入含有权利要求1所述引物P-1、P-2、P-3和P-4的反应混合液和待检样品，配成双重PCR反应体系混合液；进...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔淼，黎晶晶，张辉杰，张其中，许德麟，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44