一种丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分型方法技术

本发明专利技术公开了一种丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分型方法。本方法通过对丙二酸盐克罗诺杆菌的四种CRISPR分子进行DNA测序，提取序列中的间隔序列，根据几者的间隔序列组合确定丙二酸盐克罗诺杆菌的CRISPR型别。本发明专利技术方法简单、快速、低成本、分辨率高于MLST分型方法，无环境污染，对实验室设备要求低，且CRISPR分子保存有历史侵染的噬菌体及质粒等诸多信息，可联合数据库实现全国甚至全球标准化分子溯源，适合推广至食品、检验检疫等领域。

A CRISPR typing method for Cronobacter malonate

The invention discloses a CRISPR typing method for Cronobacter malonate. In this method, four CRISPR molecules of Cronobacterium malonate were sequenced, and the spacer sequences were extracted. The CRISPR types of Cronobacterium malonate were determined according to the combination of the spacer sequences. The method of the invention is simple, fast, low cost, higher resolution than MLST typing method, no environmental pollution, low requirement for laboratory equipment, and CRISPR molecule has many information such as historically infected bacteriophages and plasmids, which can realize national or even global standardized molecular traceability in a joint database, and is suitable for popularization to the fields of food, inspection and quarantine.

【技术实现步骤摘要】
一种丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分型方法
本专利技术属于分子流行病学领域，具体涉及一种丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分型方法。
技术介绍
婴幼儿的健康一直是国家和社会关注的重点，对于人工喂养的新生儿，奶粉及其替代食品的安全至关重要。克罗诺杆菌又名阪崎肠杆菌(Cronobacter(Enterobactersakazakii))为奶粉中检出的一种强致病性细菌，可导致婴幼儿脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达40％到80％，已经引起了全球的高度重视。目前认为婴幼儿配方奶粉污染克罗诺杆菌是新生儿感染该菌的主要渠道，国际粮农组织和世界卫生组织把克罗诺杆菌属列为婴儿配方奶粉中的A类致病菌。然而近期亦出现母乳喂养的婴幼儿感染克罗诺杆菌的案例报道，时至今日，该菌的宿主和传播模型尚不清晰。同时克罗诺杆菌也可以感染老年人及免疫力低下的成年人，症状相对较轻，近期有克罗诺杆菌引发食物中毒的报道。克罗诺杆菌属包含7个种，丙二酸克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)是其中一个重要的致病种。我们前期开展的全国食源性致病菌污染调结果显示熟食，蔬菜和食用菌等食品中均发现丙二酸盐克罗诺杆菌污染的情况，建立有效的分型方法对于早期分子溯源十分必要。近年来，随着技术的进步，除了脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分辨率高，重复性好，被誉为病原微生物分子分型的“金标准”之外，其他以电泳为基础的分型手段已经少用于病原菌的分子溯源了。大量基于基因测序的分型手段应用于病原菌的分子溯源如应用广泛的多序列分型方法(multi-locussequencetyping，MLST)，核心基因组多序列分型方法(coregenomemulti-locussequencetyping，cgMLST)，全基因组多序列分型方法(wholegenomemulti-locussequencetyping，wgMLST)等，基于全基因组分型的效果是最佳的，但是基因组测序成本高，操作人员需要有较好的生物信息学分析基础，推广应用有一定的难度。CRISPR-Cas系统是近期发现的一种新的原核生物防御外来基因组包括噬菌体入侵的有效免疫机制。CRISPR-Cas系统由CRISPR分子和cas基因组成。由于CRISPR-Cas系统中的CRISPR分子保存了细菌遭受噬菌体等基因水平转移形式的外源DNA分子入侵的信息，且间隔序列的排列顺序包含时间信息，对于追溯细菌遗传进化规律具有其他分型方法无法企及的优势，因此已经被用于一些病原菌的基因分型和分子溯源研究中，如结核分枝杆菌菌株的分型，沙门氏菌，鼠疫耶尔森菌和空肠弯曲杆菌等。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种丙二酸盐克罗诺杆菌的CRISPR分型方法。本专利技术的目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分型方法，包括以下步骤：a.提取待检测菌株培养物的DNA；b.分别以步骤a的DNA作为模板，进行CRISPR1、CRISPR2位点和CRISPR3位点的PCR扩增，其中CRISPR1位点的扩增引物为E-1F和E-1R，CRISPR2位点的扩增引物为E-2F和E-2R、CRISPR3位点的扩增引物为E-3F和E-3R；对CRISPR3位点进行PCR扩增，若E-3F和E-3R扩增出条带，则加扩CRISPR6位点，若无扩增出条带，则不需要加扩CRISPR6位点，其中CRISPR6位点的扩增引物为E-6F-mal和E-3R6R；所述的引物E-1F，其序列如SEDIDNO.1所示，所述的引物E-1R，其序列如SEDIDNO.2所示，所述的引物E-2F，其序列如SEDIDNO.3所示，所述的引物E-2R，其序列如SEDIDNO.4所示；所述的引物E-3F，其序列如SEDIDNO.5所示，所述的引物E-3R，其序列如SEDIDNO.6所示；所述的引物E-6F-mal，其序列如SEDIDNO.7所示，所述的引物E-3R6R，其序列如SEDIDNO.8所示；c.分别对步骤b所述的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位点的PCR扩增产物进行DNA测序；d.提取CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位点序列中的间隔序列，根据间隔序列的组合确定丙二酸盐克罗诺杆菌的CRISPR型别。优选，采用50μL的PCR扩增体系，其中含有HSDNAPolymerase0.5μL，5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTP4μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各0.5μL，待检测菌株培养物的DNA模版1～2μL，补齐ddH2O至50μL；扩增条件为：98℃预变性1min，然后98℃10s，57～58℃5s，72℃4min，共30次循环；72℃延伸5min。优选，所述的步骤b中，若利用引物E-3F和E-3R经PCR扩增反应后检测无条带，则利用引物E-3F和E-3R6R进行PCR扩增CRISPR3位点。优选，所述的步骤c的DNA测序，其测序引物为步骤b的PCR扩增引物。本专利技术人在丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分子中均发现靶向噬菌体和质粒等外源物质的间隔序列，说明这些序列中含有菌株的重要侵染信息，可以应用于该菌感染来源的追踪和传播模型的构建，并可联合数据库实现全国甚至全球标准化分子溯源，可以推广至食品、检验检疫等领域。本专利技术方法省时，经济，分辨率高，易于操作，对实验室设备及软件要求低，且含有重要的时间顺序信息，利于菌株分子溯源。对于奶粉中丙二酸盐克罗诺杆菌的污染溯源及婴幼儿感染该菌的监测是疾病预防控制机构的重要任务之一，但目前的疾病控制机构存在高端分型设备不足及技术人员水平参差不齐等诸多问题。本专利技术的分型方法由于原理简单，操作容易，成本低廉，反应快速，高效，准确，无环境污染，且对实验室的设备要求不高，因此能在更广泛的应用于食品、检验检疫等领域，同时可以进行疾病的监测和预警。本专利技术的CRISPR分型方法具有以下优势：1.操作简单方便，对设备要求低；2.分型成本低，不到MLST分型成本的三分之一；3.与MLST分型方法相比具有更好的分辨率；4.由于CRISPR间隔序列具有特殊的时间顺序，使得该分型方法具有细菌遗传分化及地域等多重信息的优势，更适合用于疾病爆发或食品安全事件的分子流行病学溯源。本专利技术的分型方法可在未能配备复杂昂贵分型设备的实验室及基层疾控单位实施，具有较好的推广及应用价值。附图说明图1是丙二酸盐克罗诺杆菌的CRISPR分型示意图。图2是丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR的PCR扩增电泳图谱。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例164株丙二酸盐克罗诺杆菌的CRISPR分型方法(1)菌株本次实验用到的64株菌株分离自我国多个地区的奶粉，食用菌和蔬菜样，已完成传统生化鉴定和分子检测，确定为丙二酸盐克罗诺杆菌。(2)细菌DNA提取采用Magen公司的细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取上述待测64株菌株的基因组DNA，提取的DNA于-20℃保存。(3)引物合成表1CRISPR分子扩增的引物表PCR扩增中所用的引物浓度均为10μmol/L。(4)PCR扩增4.1CRISPR1扩增PCR反应体系：CRISPR1扩增PCR反应条件为：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非疾病的诊断和治疗目的的丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分型方法，其特征在于，包括以下步骤：a.提取待检测菌株培养物的DNA；b.分别以步骤a的DNA作为模板，进行CRISPR1、CRISPR2位点和CRISPR3位点的PCR扩增，其中CRISPR1位点的扩增引物为E‑1F和E‑1R，CRISPR2位点的扩增引物为E‑2F和E‑2R、CRISPR3位点的扩增引物为E‑3F和E‑3R；对CRISPR3位点进行PCR扩增，若E‑3F和E‑3R扩增出条带，则加扩CRISPR6，若无扩增出条带，则不需要加扩CRISPR6位点，其中CRISPR6位点的扩增引物为E‑6F‑mal和E‑3R6R；所述的引物E‑1F，其序列如SED ID NO.1所示，所述的引物E‑1R，其序列如SED ID NO.2所示，所述的引物E‑2F，其序列如SED ID NO.3所示，所述的引物E‑2R，其序列如SED ID NO.4所示；所述的引物E‑3F，其序列如SED ID NO.5所示，所述的引物E‑3R，其序列如SED ID NO.6所示；所述的引物E‑6F‑mal，其序列如SED ID NO.7所示，所述的引物E‑3R6R，其序列如SED ID NO.8所示；c.分别对步骤b所述的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位点的PCR扩增产物进行DNA测序；d.提取CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位点序列中的间隔序列，根据间隔序列的组合确定丙二酸盐克罗诺杆菌的CRISPR型别。...

【技术特征摘要】
1.一种非疾病的诊断和治疗目的的丙二酸盐克罗诺杆菌CRISPR分型方法，其特征在于，包括以下步骤：a.提取待检测菌株培养物的DNA；b.分别以步骤a的DNA作为模板，进行CRISPR1、CRISPR2位点和CRISPR3位点的PCR扩增，其中CRISPR1位点的扩增引物为E-1F和E-1R，CRISPR2位点的扩增引物为E-2F和E-2R、CRISPR3位点的扩增引物为E-3F和E-3R；对CRISPR3位点进行PCR扩增，若E-3F和E-3R扩增出条带，则加扩CRISPR6，若无扩增出条带，则不需要加扩CRISPR6位点，其中CRISPR6位点的扩增引物为E-6F-mal和E-3R6R；所述的引物E-1F，其序列如SEDIDNO.1所示，所述的引物E-1R，其序列如SEDIDNO.2所示，所述的引物E-2F，其序列如SEDIDNO.3所示，所述的引物E-2R，其序列如SEDIDNO.4所示；所述的引物E-3F，其序列如SEDIDNO.5所示，所述的引物E-3R，其序列如SEDIDNO.6所示；所述的引物E-6F-mal，其序列如SEDIDNO.7所示，所述的引物E-3R6R，其序列如SEDIDNO.8所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾海燕，吴清平，李程思，张菊梅，杨小鹃，王涓，丁郁，陈谋通，张淑红，叶青华，雷涛，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，广东环凯微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44