猪INF-γ的优化基因和采用该优化基因制备猪INF-γ的方法及其注射液和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪INF‑γ的优化基因和采用该优化基因制备猪INF‑γ的方法及其注射液和应用，所述猪INF‑γ的优化基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述制备方法包括：1)将权利要求1所述的基因序列克隆到真核表达载体中，得到重组真核表达载体；2)将步骤1)中所述重组真核表达载体转染CHO细胞，通过培养、筛选和驯化，得到高效表达猪INF‑γ的CHO细胞株；以及3)将步骤2)中所述CHO细胞株进行发酵培养，从发酵培养上清中纯化得到猪INF‑γ。所述注射液包括60μg猪INF‑γ与

Optimized gene for porcine INF- gamma and method for preparing porcine INF- gamma using the optimized gene and its injection and Application

The invention discloses an optimized gene for pig INF gamma gamma and a method for preparing pig INF gamma gamma using the optimized gene, and its injection and application. The gene sequence of the optimized gene of pig INF gamma gamma is shown as SEQ ID NO.1. The preparation method includes: 1) cloning the gene sequence described in claim 1 and obtaining the recombinant eukaryotic expression vector; 2) step 1). The recombinant eukaryotic expression vector was transfected into CHO cells. Through culture, screening and domestication, a CHO cell strain expressing INF CHO was highly expressed. 3) the CHO cell strain was cultured and purified from the fermentation culture supernatant. The injection includes 60 micron g INF pig gamma and

【技术实现步骤摘要】
猪INF-γ的优化基因和采用该优化基因制备猪INF-γ的方法及其注射液和应用
本专利技术涉及一种稳定高效分泌表达猪INF-γ的CHO细胞株及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品

技术介绍
干扰素(Interferon，IFN)是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的，是一种细胞因子，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。干扰素本质是由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白，根据产生的细胞来源不同、理化性质和生物学活性差异等方面可以分为I型和II型IFN；I型IFN主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ζ和τ等，II型IFN只有IFN-γ一种。IFN-γ虽然只有一种基因，但其结构更为复杂，如编码人和鼠IFN-γ的基因长约6Kb，各包含有4个外显子和3个内含子。IFN-γ与I型干扰素(IFN-α与IFN-β)在基因和蛋白质水平上没有明显的相关性(DeGrado,etal,1991)。虽然IFN-γ具有其它干扰素大多数的生物学活性，但在特异性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫调节活性方面要高100-10000倍(Pace,etal,1985)。猪IFN-γ全基因编码166个氨基酸残基，其中包括20aa的信号肽(Dijkmans,etal,1990)，信号肽切除后，产生146个氨基酸的IFN-γ单体，分子量为17.3kD，天然活性状态的IFN-γ是由两个IFN-γ单体经非共价交联形成的同源二聚体糖蛋白((Boehm,etal,1997)。猪IFN-γ与人、小鼠、猫和犬的IFN-γ分别具有60％,41％,72％和72％的同源性，而与IFN-β及IFN-α家族没有明显的同源性(FarrarandSchreiber,1993)。目前，对猪INF-γ的制备主要有大肠杆菌表达、酵母表达、昆虫杆状病毒表达。这些表达方式制备猪INF-γ都存在了表达量低、抗病毒活性较低(糖基化修饰低或没有，与天然蛋白存在较大差异导致)、工艺复杂、产业化困难(成本的高低决定了兽用生物制品的产业化)等缺陷。截止目前为止，兽用生物制品中还没有真核细胞表达的重组干扰素的产品，这主要还是因为产量低、成本高导致产业化困难。另外，在蛋白类药物中，单独直接使用未经修饰的蛋白作为药物，在药代学上来看，药物的半衰期都很短，一般就几个小时。因此，为了延长药物的半衰期和剂量，一般都选择对目的蛋白进行修饰。但是，修饰都会极大的增加成本，不利于药物的推广，特别是在猪用药物中的推广。因此，研发一种可以适当延长半衰期且成本低的注射液是非常必要的，特别是在该药物的推广使用过程中。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题一是提供一种适合在真核表达细胞中，特别是在CHO细胞中表达重组猪INF-γ蛋白的猪INF-γ优化基因序列；二是提供一种成本低、易于推广应用、易于产业化生产的真核细胞制备猪INF-γ的方法；二是克服现有技术中表达量低、抗病毒活性较低(糖基化修饰低或没有，与天然蛋白存在较大差异导致)、工艺复杂、产业化困难等缺陷；三是提供了一种可延长半衰期且成本低的注射液及其制备方法。根据本专利技术的一个方法，本专利技术在充分研究CHO细胞蛋白表达时的偏嗜性以及猪INF-γ原始基因序列(如SEQIDNO.2所示)的基础上，优化了猪INF-γ的基因序列，所述优化后的猪INF-γ的基因序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种制备猪INF-γ的方法，该方法包括以下步骤：1)将权利要求1所述的基因序列克隆到真核表达载体中，得到重组真核表达载体；2)将步骤1)中所述重组真核表达载体转染CHO细胞，通过培养、筛选和驯化，得到高效表达猪INF-γ的CHO细胞株；以及3)将步骤2)中所述CHO细胞株进行发酵培养，从发酵培养上清中纯化得到猪INF-γ。本专利技术的技术方案中，优选地，所述真核表达载体为pEE12.4。本专利技术的技术方案中，优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。本专利技术的技术方案中，优选地，在所述发酵培养时，将培养基CD-CHO和培养基Ex-cell302混合，以得到混合培养基，其中，所述培养基CD-CHO和所述培养基Ex-cell302的体积比为8:2。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了一种猪INF-γ注射液，所述猪INF-γ注射液含有本方法制备的猪INF-γ和一种水溶性佐剂，所述注射液中猪INF-γ的浓度为60μg/ml。本专利技术的技术方案中，优选地，所述水溶性佐剂为70。本专利技术的技术方案中，优选地，含有所述猪INF-γ的蛋白缓冲液与70按照体积比为4:1的比例混合，其中，缓冲液为PBS。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了一种将优化后的猪INF-γ的基因序列在重组猪INF-γ蛋白的表达中应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了一种猪INF-γ在猪病的治疗和保健中的应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了一种猪INF-γ作为免疫增强剂在猪疫苗中的应用。本专利技术人一开始在制备猪INF-γ重组蛋白时，使用的是猪INF-γ的原始基因序列(如SEQIDNO.2所示)，将该序列导入pEE12.4载体中，并使用CHO-K1细胞进行表达，但是本专利技术人未检测到猪INF-γ的表达或表达量太低，这说明使用原始基因序列在CHO细胞中表达猪INF-γ蛋白是不可取的，必须要对原始序列进行优化。本专利技术人在前述失败的基础上，对猪INF-γ的原始基因序列(如SEQIDNO.2所示)进行了深度优化，再使用优化后的基因序列在CHO细胞中进行表达，该优化后的序列在CHO细胞中表达时具有产量高(猪INF-γ产量最低能达到500mg/L)、易于纯化(表达出来的INF-γ为分泌表达，杂蛋白少，直接从细胞上清中纯化)、成本低、抗病毒活性强(使用CHO细胞表达的猪INF-γ更接近于生物体内自然表达的猪INF-γ)、适合大规模工业化生产等优点。本专利技术的另一方面提供了一种治疗猪疾病用的猪INF-γ注射液及其制备方法，该注射液在治疗病猪时有非常好的疗效，该注射液不仅克服了单独使用未经修饰猪INF-γ作为药物时半衰期短的问题，还克服了对猪INF-γ进行修饰时成本高的问题，在一个实施例中，注射液实验组比对照组(常规化药治疗)的平均日增重要高0.09kg/天，且注射液实验组比另一个实验组(猪INF-γ未配制成注射液进行治疗)的平均日增重要高0.04kg/天(这是因为配制成注射液后，可以延长猪INF-γ蛋白在猪体内的半衰期且有一定的缓释作用)；且在观察的30天内2组实验组都没有死亡(对照组死亡3头)。本专利技术比较了不同制备方法制备的猪INF-γ在病猪治疗方面作用，发现本专利技术的方法制备的猪INF-γ(注射液4)在病猪治疗方法比其他3种方法要好，这可能主要是因为CHO系统表达的猪INF-γ更接近于猪体内表达的猪INF-γ，所以在治疗方面较其他的要好。且酵母表达系统制备的(注射液1)和昆虫杆状病毒表达系统制备的(注射液2)在病猪治疗方法较大肠杆菌表达系统制备的(注射液3)，这可能主要是因为大肠杆菌表达系统不具备翻译后修饰和糖基化的功能，而其他两种系统都有一定程度的糖基化修饰功能。本专利技术的另一方面还提供了一种将猪IN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪INF‑γ的优化基因，其特征在于，所述优化基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪INF-γ的优化基因，其特征在于，所述优化基因的基因序列如SEQIDNO.1所示。2.一种使用权利要求1所述优化基因制备猪INF-γ的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将权利要求1所述的基因序列克隆到真核表达载体中，得到重组真核表达载体；2)将步骤1)中所述重组真核表达载体转染CHO细胞，通过培养、筛选和驯化，得到高效表达猪INF-γ的CHO细胞株；以及3)将步骤2)中所述CHO细胞株进行发酵培养，从发酵培养上清中纯化得到猪INF-γ。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEE12.4。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤3)所述发酵培养时，将培养基CD-CHO和培养基Ex...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱泓，吴有强，卞广林，张强，徐玉兰，吴素芳，车影，吕洋萍，闻雪，查银河，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33