铜绿假单胞菌群体感应体系抑制剂的快速筛选模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，分别在大肠杆菌中导入质粒用于模拟铜绿假单胞菌的las系统、rhl系统和PQS信号系统三种群体感应系统，得到las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型，选取其中一种或一种以上的组合作为铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，通过本发明专利技术所述的筛选体系筛选铜绿假单胞菌群体感应抑制，在加入待筛选药物后，仅需培养3.5～6小时，小于传统筛选方法所需的24h，大大缩短了筛选时间。

A Rapid Screening Model for Quorum Sensing System Inhibitors of Pseudomonas aeruginosa and Its Construction Method

The invention provides a screening system for quorum sensing inhibitors of Pseudomonas aeruginosa. Plasmids are introduced into Escherichia coli to simulate three quorum sensing systems of Pseudomonas aeruginosa, namely, Las system, RHL system and PQS signal system. The screening models of Las system, RHL system and PQS signal system are obtained, and one or more combinations of them are selected as copper. The screening system of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing inhibitors is used to screen Pseudomonas aeruginosa quorum sensing inhibitors by the screening system described in the present invention. After adding the drug to be screened, only 3.5-6 hours of cultivation are needed, which is less than 24 hours required by the traditional screening method, and the screening time is greatly shortened.

【技术实现步骤摘要】
铜绿假单胞菌群体感应体系抑制剂的快速筛选模型及其构建方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种快速筛选铜绿假单胞菌群体感应体系抑制剂的方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌是常见的革兰氏阴性菌，为临床上常见的能引起严重感染的机会致病菌之一，其对抗菌药物存在天然或获得性的多重耐药性，治疗难度较大。群体感应(Quorumsensing,QS)是细菌之间通过产生、释放并感知信号分子来进行细菌信息交流的一种机制。细菌本身会产生一系列的自诱导信号分子，其可根据信号分子的浓度来检测周围环境中自身或其他细菌的数量变化，当细菌密度达到一定时，信号分子浓度达到阈值，细菌会启动相关基因的表达，如产生毒力因子，形成生物膜，菌体发光或产生色素等。铜绿假单胞菌的群体感应系统主要由基于酰基高丝氨酸内酯化合物(N-acyl-homoserinelactones,AHLs)的las和rhl系统以及PQS信号系统组成。las系统由信号分子受体LasR和AHL信号分子合成酶LasI组成，rhl系统由信号分子受体RhlR和AHL信号分子合成酶RhlI组成。其中las系统的信号分子为N-3-氧十二酰基高丝氨酸内酯(N-3-oxododecanoyl-homoserinelactone,3-oxo-C12-HSL)，rhl系统的信号分子为正丁基高丝氨酸内酯(N-butyl-homoserinelactone,C4-HSL)。当这两个系统的受体蛋白和信号分子形成复合物，结合到靶基因DNA启动子区域时，就会激活一系列毒力基因如弹性蛋白酶和绿脓菌素等。PQS信号系统是以PqsR为受体蛋白，2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone,PQS)为信号分子的调控系统，PQS与PqsR蛋白结合后，会调控如弹性蛋白酶、绿脓菌素和凝集素等毒力因子的表达。铜绿假单胞菌毒力因子的表达和生物膜的形成都受群体感应系统调控，因此，抑制细菌的群体感应系统，可以在不杀死细菌的情况下抑制其致病性。与传统的抗菌药物相比，群体感应抑制剂不会对细菌耐药性产生选择性压力，理论上不会引起细菌耐药性的产生。快速筛选高效的群体感应抑制剂，将成为解决铜绿假单胞菌感染和耐药性问题的有效途径。传统的筛选细菌群体感应体系的方法用细菌生物感应器紫色杆菌CV026和乙酰基高丝氨酸内酯进行检测，其需要24小时，时间太长。因此有必要提供一种用于快速筛选铜绿假单胞菌群体感应体系抑制剂的方法。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种用于快速筛选铜绿假单胞菌群体感应体系抑制剂的方法。为实现上述目的，本专利技术具体技术方案如下：一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，包括：las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型中的至少一种；所述las系统筛选模型为：含有质粒A和质粒B的大肠杆菌；所述质粒A上包含有LasR蛋白的编码序列；所述质粒B包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与LasR蛋白结合的启动子；所述rhl系统筛选模型为：含有质粒C和质粒D的大肠杆菌；所述质粒C上包含有RhlR蛋白的编码序列；所述质粒D包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与RhlR蛋白结合的启动子；所述PQS信号系统筛选模型为：含有质粒E和质粒F的大肠杆菌；所述质粒E上包含有PqsR蛋白的编码序列；所述质粒F包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与PqsR蛋白结合的启动子。在其中一些实施例中，所述铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系包括las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型。在其中一些实施例中，所述可以与LasR蛋白结合的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在其中一些实施例中，所述可以与RhlR蛋白结合的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。在其中一些实施例中，所述可以与PqsR蛋白结合的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。在其中一些实施例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α菌株。本专利技术还提供了一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系的构建方法，具体技术方案如下：一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系的构建方法，包括构建las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型中的至少一种，其中，(1)构建质粒A和质粒B，所述质粒A上包含有LasR蛋白的编码序列；所述质粒B包含有荧光素酶的编码序列，所述荧光素酶的编码序列上带有可以与LasR蛋白结合的启动子；将所述质粒A和所述质粒B共转导至大肠杆菌中，得las系统筛选模型；(2)构建质粒C和质粒D，所述质粒C上包含有RhlR蛋白的编码序列；所述质粒D包含有荧光素酶的编码序列，所述荧光素酶的编码序列上带有可以与RhlR蛋白结合的启动子；将所述质粒C和所述质粒D共转导至大肠杆菌中，得rhl系统筛选模型；(3)构建质粒E和质粒F，所述质粒E上包含有PqsR蛋白的编码序列；所述质粒F包含有荧光素酶的编码序列，所述荧光素酶的编码序列上带有可以与PqsR蛋白结合的启动子；将所述质粒C和所述质粒D共转导至大肠杆菌中，得PQS信号系统筛选模型。本专利技术还提供了一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选方法，具体技术方案如下：一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选方法，包括：(1)向使用las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型中的任一项中所述的大肠杆菌中，加入阿拉伯糖诱导剂和自诱导小分子；(2)荧光强度抑制实验：药物组：分别加入待筛选药物，培养3.5～6h后，检测荧光强度和细菌数量；溶剂组：加入空白溶剂，培养3.5～6h后，检测荧光强度和细菌数量；(3)对比所述药物组和所述溶剂组的荧光强度变化。在其中一些实施例中，步骤(1)为：在对数生长中期的大肠杆菌培养液中，加入0.08％～0.12％的阿拉伯糖诱导剂和8～12μM的自诱导小分子。在其中一些实施例中，所述las系统筛选模型中使用的自诱导小分子为N-3-氧十二酰基高丝氨酸内酯；所述rhl系统筛选模型中使用的自诱导小分子为正丁基高丝氨酸内酯；所述PQS信号系统筛选模型中使用的自诱导小分子为2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮。在其中一些实施例中，步骤(3)所述对比所述药物组和所述溶剂组的荧光强度变化包括：分别计算药物组和溶剂组的荧光强度和细菌数量的比值，得单位荧光强度；以所述溶剂组的单位荧光强度为100％计，所述药物组的单位荧光强度≤70％时，待筛选药物为具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性的药物。基于上述技术方案，本专利技术具有以下效果：本专利技术通过大量创造性劳动，分别在大肠杆菌中导入质粒用于模拟铜绿假单胞菌的las系统、rhl系统和PQS信号系统三种群体感应系统，得到las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型，选取其中一种或一种以上的组合作为铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系。本专利技术向所述的筛选模型中加入诱导剂和自诱导分子后，自诱导分子与受体蛋白形成复合体，复合体结合到靶基因的启动子区域，激活荧光素酶的表达，从而可以通过荧光强度可视化地体现群体感应效应的发生。当待筛选药物能够抑制筛选模型的荧光强度时，说明其可以干扰或抑制铜绿假单胞菌的群体感应效应。通过本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，其特征在于，包括：las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型中的至少一种；所述las系统筛选模型为：含有质粒A和质粒B的大肠杆菌；所述质粒A上包含有LasR蛋白的编码序列；所述质粒B包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与LasR蛋白结合的启动子；所述rhl系统筛选模型为：含有质粒C和质粒D的大肠杆菌；所述质粒C上包含有RhlR蛋白的编码序列；所述质粒D包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与RhlR蛋白结合的启动子；所述PQS信号系统筛选模型为：含有质粒E和质粒F的大肠杆菌；所述质粒E上包含有PqsR蛋白的编码序列；所述质粒F包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与PqsR蛋白结合的启动子。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，其特征在于，包括：las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型中的至少一种；所述las系统筛选模型为：含有质粒A和质粒B的大肠杆菌；所述质粒A上包含有LasR蛋白的编码序列；所述质粒B包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与LasR蛋白结合的启动子；所述rhl系统筛选模型为：含有质粒C和质粒D的大肠杆菌；所述质粒C上包含有RhlR蛋白的编码序列；所述质粒D包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与RhlR蛋白结合的启动子；所述PQS信号系统筛选模型为：含有质粒E和质粒F的大肠杆菌；所述质粒E上包含有PqsR蛋白的编码序列；所述质粒F包含有荧光素酶的编码序列；所述荧光素酶的编码序列上带有可以与PqsR蛋白结合的启动子。2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，其特征在于，包括：las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型。3.根据权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，其特征在于，所述可以与LasR蛋白结合的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，其特征在于，所述可以与RhlR蛋白结合的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。5.根据权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系，其特征在于，所述可以与PqsR蛋白结合的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。6.一种铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选体系的构建方法，其特征在于，包括构建las系统筛选模型、rhl系统筛选模型和PQS信号系统筛选模型中的至少一种；其中：(1)构建质粒A和质粒B，所述质粒A上包含有LasR蛋白的编码序列；所述质粒B包含有荧光素酶的编码序列，所述荧光素酶的编码序列上带有可以与LasR蛋白结合的启动子；将所述质粒A和所述质粒B共转导至大肠杆菌中，得las系统筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏炜，谢燕璇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44