一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株制造技术

本发明专利技术提供一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株所述菌株为Pseudomonas plecoglossicida fliA‑RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2018770。所构建的变形假单胞菌fliA基因沉默菌株的毒力显著低于变形假单胞菌野生株的毒力，在同等感染条件引起的死亡起始时间延后，死亡率大大降低，为研制变形假单胞菌减毒疫苗奠定了理论基础。

FlA gene silencing strain of Pseudomonas mutans

The invention provides a fliA gene silencing strain of Pseudomonas plecoglossicida fliA RNAi, which has been stored in a typical culture preservation center of China on November 12, 2018, and the preservation number is CCTCC NO: M 2018770. The virulence of the constructed fliA gene silencing strain of Pseudomonas mutans was significantly lower than that of the wild strain of Pseudomonas mutans. The mortality rate of the strain was greatly reduced after delaying the initial time of death caused by the same infection conditions, which laid a theoretical foundation for the development of attenuated vaccine of Pseudomonas mutans.

【技术实现步骤摘要】
一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株
本专利技术属于微生物
，更具体涉及一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株。
技术介绍
变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)是大黄鱼、斜带石斑鱼等海水养殖鱼类“内脏白点病”的病原菌，每年造成的直接经济损失超亿元。fliA基因是鞭毛合成中的关键基因，其编码的FliA（σ28）蛋白在鞭毛合成中至关重要。σ28是鞭毛合成中的正调控蛋白，其决定着第三类鞭毛启动子是转录，第三类鞭毛启动子控制着鞭毛晚期基因的转录，鞭毛晚期基因编码鞭毛的马达蛋白，趋势蛋白和鞭毛丝蛋白。当细菌缺失fliA基因后，其运动能力，膜形成能力及致病性都有所减弱。在先前的研究中，与野生型变形假单胞菌(在18℃下培养)的纯培养相比，在感染后24，48，72和96小时，fliA基因表达量皆上调。通过大黄鱼感染实验，发现变形假单胞菌fliA基因沉默突变株引起的死亡起始时间延后，死亡率大大降低。变形假单胞菌fliA沉默突变株为研制变形假单胞菌减毒疫苗奠定了理论基础，为研究变形假单胞菌引发的内脏白点病防治工作提供了潜在靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株，所述菌株为PseudomonasplecoglossicidafliA-RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M2018770，地址为武汉武汉大学。本专利技术提供的这株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株是通过下面的技术手段进行构建，（1）：通过比较分析变形假单胞菌感染宿主互作转录组数据，筛选到感染过程中表达量提高的fliA基因；（2）：合成shRNA，退火后连入pCM130/tac载体，通过电转技术导入变形假单胞菌感受态细胞，构建变形假单胞菌fliA基因沉默突变株；利用QPCR技术，对沉默效果进行检验，最终获得构建变形假单胞菌fliA基因沉默突变株。所述的pCM130/tac载体是利用质粒pCM130加上启动子tac构成。（3）利用人工感染实验，研究变形假单胞菌野生株、fliA基因沉默突变株的毒力，以及fliA基因沉默对变形假单胞菌及大黄鱼基因表达的影响。通过基因测序和比对，本专利技术提供的菌株为一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株。本专利技术的优点在于：人工感染实验结果表明，变形假单胞菌fliA基因沉默突变株的毒力显著低于变形假单胞菌野生株的毒力，在同等感染条件引起的死亡起始时间延后，死亡率大大降低，为研制变形假单胞菌减毒疫苗奠定了理论基础。DualRNA-seq分析结果表明，变形假单胞菌fliA基因的稳定沉默不仅能够显著影响变形假单胞菌的转录组表达，而且也能显著影响大黄鱼的转录组表达，这为研究变形假单胞菌引发的内脏白点病防治工作提供了潜在靶点。附图说明图1大黄鱼被变形假单胞菌后的生存率。图中黑色细线代表被变形假单胞菌野生株感染的大黄鱼生存率；灰色细线代表被变形假单胞菌fliA沉默突变株感染的大黄鱼生存率；黑色粗线代表被PBS注射的大黄鱼生存率。图2大黄鱼脾脏被变形假单胞菌各菌株感染后的表型。第一个方框中的是被变形假单胞菌野生株感染的大黄鱼第3天的脾脏；第二个方框中的是被变形假单胞菌fliA沉默突变株感染的大黄鱼第7天的脾脏；第三个方框中的是注射PBS的鱼的脾脏。图3大黄鱼不同器官对于变形假单胞菌载量测定。图中横坐标是感染后的时间；纵坐标是该组织中变形假单胞菌fliA沉默突变株数量相较于野生株的比值。不同填充形状的柱子代表不同的组织：小网格填充的是脾脏；大网格填充的是体肾；横线填充的是血液；竖线填充的是肝脏。具体实施方式实施例1本专利技术实施例提供的变形假单胞菌fliA基因稳定沉默菌株的构建方法包括以下步骤：S101：通过比较转录组学分析技术，对变形假单胞菌基因表达水平进行检测，发现fliA基因在感染过程中表达量显著提高。查阅文献后，发现铜绿假单胞菌fliA基因敲除突变株不能合成鞭毛，运动性下降，在小鼠肠道中的增殖能力减弱；嗜肺军团菌fliA基因突变株的运动性下降，成膜能力减弱，对巨噬细胞和宿主细胞的侵染能力和增殖能力都减弱。因此挑选fliA基因；S102：利用Thermo-fisherScientific公司在线shRNA设计工具（http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.dodesignOption=shrna&pid=708587103220684543），设计并合成shRNA，然后使用退火缓冲液退火形成双链shRNA。构建变形假单胞菌fliA沉默突变株shRNA序列，shRNA序列F:5’-TGGTCAAGCGCATTGTCAATCATTCAAGAGATGATTGACAATGCGCTTGACCTTTTTTT-3’，R:5’-GTACAAAAAAAGGTCAAGCGCATTGTCAATCATCTCTTGAATGATTGACAATGCGCTTGACCATGCA-3’（5’-3’），从百奥迈科公司购买原始质粒pCM130加上去的启动子tac，构成pCM130/tac质粒。使用限制性内切酶BsrGI和NsiI双酶切pCM130/tac质粒使其线性化，然后使用T4连接酶将线性化质粒和双链shRNA连接。将重组质粒先热击转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃扩大培养，测序成功后提取重组质粒，电击转化进变形假单胞菌感受态细胞中，18℃条件下扩大培养。此菌株即为变形假单胞菌fliA沉默突变株。所述变形假单胞菌fliA沉默突变株为PseudomonasplecoglossicidafliA-RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M2018770，地址为武汉，武汉大学。使用qRT-PCR技术，对沉默效果进行检验，上游引物序列（5’-3’’）为：CGAGGGTTTCTTCAGAGCGGTAC，下游引物序列（5’-3’’）为：GCACCAGGCCAATTTCTTTAAGAT，检验结果与转录组测序结果一致，感染后fliA基因表达量上调；S103：利用人工感染实验，对变形假单胞菌野生株和fliA沉默突变株的毒力进行对比。变形假单胞菌野生株、fliA沉默突变株和PBS（NaCl0.8g、KCl0.02g、Na2HPO40.36g、KH2PO40.024g、H2O1L）分别对三组大黄鱼进行前鳍鳍下胸腔注射感染，每条鱼注射0.2mL，菌株感染浓度为104cfu/g，长度大小相当的大黄鱼每组60尾，然后在水温18℃的海水中饲养，每天记录各组鱼的存活状况。探讨了大黄鱼感染变形假单胞菌fliA沉默突变株存活的情况。注射PBS的大黄鱼，在注射后未观察到长达14天都没观察到死亡。注射变形假单胞菌野生株的大黄鱼，第3天出现死亡，第5天全部死亡，存活率0。注射变形假单胞菌fliA沉默突变株的大黄鱼，第6天出现死亡，第10天不再出现死亡，存活率上升30%(图1)。注射含有变形假单胞菌野生株的鱼的脾脏中在第3天观察到大量白色结节，表现出与自然疾病相同的症状，而达到相同的表型症状本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株变形假单胞菌

【技术特征摘要】
1.一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株，其特征在于：所述菌株为PseudomonasplecoglossicidafliA-RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M2018770。2.如权利要求1所述的一株变形假单胞菌fliA基因沉默菌株的构建方法，其特征在于：（1）：通过比较分析变形假单胞菌感染宿主互作转录组数据，筛选到感染过程中表达量提高的fliA基因；（2）：合成shRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：鄢庆枇，孙瑜佳，赵玲敏，黄力行，覃映雪，徐晓津，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建,35