一种高效发酵生产甾药前体的方法技术

本发明专利技术属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体的方法。本发明专利技术将通过过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体，以解决微生物法甾药前体生产时存在的发酵周期长、生产效率低的问题，为甾药前体生产成本的降低提供新方法。

A High Efficiency Fermentation Method for Producing Steroid Precursors

The invention belongs to the field of biocatalysis technology, in particular to a method for improving the viability of steroid producing strains and producing steroid precursors by efficient fermentation. By overexpressing type II NADH dehydrogenase gene to improve the viability of steroid producing strains, the invention can efficiently ferment steroid precursors to solve the problems of long fermentation period and low production efficiency in the production of steroid precursors by microbial method, and provide a new method for reducing the production cost of steroid precursors.

【技术实现步骤摘要】
一种高效发酵生产甾药前体的方法
：本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体的方法。
技术介绍
：甾体药物简称甾药是制药工业中主要销售的产品并在临床上被广泛用。已知植物甾醇可被许多微生物分解代谢为一系列甾药前体。其中，4-雄甾烯-3,17-二酮(AD)和1,4-雄甾烯-3,17-二酮(ADD)是合成类固醇药物如孕激素，避孕药和雌激素的主要前体。据报道，快速生长的土壤分枝杆菌具有较强的降解植物甾醇侧链积累AD和ADD的能力。作为化学合成的替代，生物转化已成为制药工业中生产甾药前体的主要生产方法。但无论是原始菌株还是工程菌株均具有较长的转化周期(≥5天)，且在转化中后期(3天之后)菌株的活力明显下降，并伴随转化效率的急剧降低。这也是造成甾药前体生产成本高昂的原因之一。
技术实现思路
：针对上述问题，本专利技术将通过提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体，以解决微生物法甾药前体生产时存在的发酵周期长、生产效率低的问题，为甾药前体生产成本的降低提供新方法。本专利技术实现上述目的的技术方案之一，是通过构建Ⅱ型NADH脱氢酶加强的甾药前体基因工程生产菌株，从而提高菌株细胞活力，高效发酵生产甾药前体；所述基因工程生产菌株是以分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)MNRM3为宿主细胞，以pMV261质粒为表达载体，过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因获得的；所述Ⅱ型NADH脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，来源于快速生长型分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)MNRM3,保藏编号CICC21097；本专利技术所提供的技术方案之二，是上述基因工程生产菌株的应用；进一步的，上述基因工程生产菌株应用于普通发酵生产AD的方法如下：将上述基因工程生产菌株的种子液按2-10％(种子液与废弃油+发酵培养基的体积比)的接种量转接于含5-20％(体积比)废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养24-168h，AD产量达到0.5-25g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；进一步的，上述基因工程生产菌株应用于分批发酵生产AD的方法如下：将上述基因工程生产菌株的种子培养液以2-20％的接种量转接于含5-20％(体积比)废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养5天(首批次)；首批次发酵结束后进行重复分批发酵，在每批发酵结束时取出50-90％的培养物并补充等量的新鲜高压灭菌发酵培养基和废弃油，取出部分用于产物提取；除首批次外，剩余批次发酵时间为3天，所有培养批次在相同的培养条件下进行，共进行五批发酵，五批发酵后AD产量达到0.5-25g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；所述的废弃油包括但并不限于过期的动植物油商品，食品、餐饮行业煎炸使用后废弃的动植物油以及地沟油处理后的上清油。所述发酵培养基组成：K2HPO40.1-3g/L，MgSO40.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，磷酸氢二铵1-10g/L，葡萄糖5-50g/L，植物甾醇1-50g/L，其余为水，pH6.0-7.5。有益效果：本专利技术通过构建Ⅱ型NADH脱氢酶加强的甾药前体生产基因工程菌，使分枝杆菌的细胞活力提高了32％。意外的发现该酶加强的基因工程菌胞内活性氧的释放减少42.32％，在提高AD产量方面48-168小时的各取样点摩尔转化率均提高1.19倍以上，最高1.62倍。在基因工程菌重复批次发酵过程中，没有明显的生长延滞期，菌体可迅速进入指数期。在基因工程菌重复批次发酵生产AD过程中，第一批次AD的生产速率为0.65g/(L·d)；第二到第五批次AD的生产速率平均值为1.03g/(L·d)。无论是第二到第五批次每批次的AD的生产速率还是其平均值均比第一批次至少高40％以上。AD的生产效率得到大幅度提高。附图说明：图1为Ⅱ型NADH脱氢酶基因的扩增产物核酸电泳图其中泳道M是DNA标准marker，泳道1-2是Ⅱ型NADH脱氢酶基因扩增条带；图2为pMV261-ndh载体构建过程的酶切验证图谱其中泳道M是DNA标准marker，泳道1是pMV261-ndh经BamHⅠ单酶切结果，泳道2是pMV261-ndh经BamHⅠ、HindⅢ双酶切结果；图3为原始菌株MNR及重组菌株NdhN转化过程中菌株活力随时间的变过程；图4为原始菌株MNR及重组菌株NdhN生成AD过程图；图5为原始菌株MNR及重组菌株NdhN转化过程中活性氧生成量随时间的变过程；图6利用NdhN在煎炸废弃油重复分批发酵生产AD的情况。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。实施例1Ⅱ型NADH脱氢酶基因(ndh)的获得将保藏编号为CICC21097的菌株(以下简称MNR)接种于含有植物甾醇的基础培养基中(葡萄糖10g/L,MgSO40.5g/L,K2HPO40.5g/L,(NH4)2HPO43.5g/L,柠檬酸2g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，植物甾醇5g/L)培养60小时以获得样品用于转录组测序。将获得的基因转录本序列在NCBI的非冗余蛋白质序列数据库和KEGG的蛋白数据库中进行比对，以获得与每基因转录本序列具有最高序列相似性的蛋白。该蛋白的信息即为每个基因转录本序列对应的蛋白的功能注释信息。从注释信息中搜索NADHdehydrogenase所得到的基因转录本序列即为Ⅱ型NADH脱氢酶基因。以该序列为模板设计引物ndh-F和ndh-R，其序列分别如下：ndh-F：5’-CGCGGATCCAATGAGCCATCCCGGAGCT-3’(SEQIDNO.2)ndh-R：5'-CCCAAGCTTCTAGGACGCGGCCTTCTC-3'(SEQIDNO.3)以MNR菌株总DAN为模板，以引物ndh-F和ndh-R为引物对，进行PCR扩增以获得MNR的Ⅱ型NADH脱氢酶基因(SEQIDNO.1所示)。扩增产物经核酸电泳检测(图1)。实施例2构建用于Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达基因工程表达载体构建用于Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达基因工程表达载体，其过程包括：将实施例1中获得的Ⅱ型NADH脱氢酶基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后胶回收，与经同样酶切的pMV261质粒在T4DNA连接酶的作用下16℃连接过夜，连接产物经化学转化的方法转入EscherichiacoliDH5α，经卡那霉素筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒经酶切验证(图2)和测序后得到构建成功的用于Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达基因工程表达载体pMV261-ndh。实施例3构建Ⅱ型NADH脱氢酶基因自身过表达菌株NdhN分枝杆菌MNR感受态细胞制备：将MNR菌株接种到LB培养基中，30℃培养至OD600为1.0左右，按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分别用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍发酵液体积的10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存；电转化：取10μL实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甾药前体基因工程生产菌株，其特征在于，所述基因工程生产菌株是以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3为宿主细胞，以pMV261质粒为表达载体，过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因获得的；所述Ⅱ型NADH脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示。

【技术特征摘要】
1.一种甾药前体基因工程生产菌株，其特征在于，所述基因工程生产菌株是以分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)MNRM3为宿主细胞，以pMV261质粒为表达载体，过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因获得的；所述Ⅱ型NADH脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。2.权利要求1所述甾药前体基因工程生产菌株的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用普通发酵法生产AD的方法如下：将上述基因工程生产菌株的种子液按2-10％的接种量转接于含5-20％废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养24-168h。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用分批发酵法生产AD的方法如下：将上述基因工程生产菌株的种子培养液以2-20％的接种量转接于含5-20％废弃油的发酵培养基中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，张扬，申雁冰，周秀玲，骆健美，夏梦雷，张振建，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12