本发明专利技术公开了一种强化脂肪酸降解和乙醛酸循环提高苏氨酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明专利技术通过加强脂肪酸降解和削弱脂肪酸合成，并加快乙醛酸循环，有效提高了苏氨酸产量。应用本发明专利技术的方法构建的菌株TWF044的苏氨酸产量达到21.64g/L，与出发菌株相比提高了75％，转化率对应也提高了75％。
A Method of Enhancing Fatty Acid Degradation and Glyoxylic Acid Cycle to Increase Threonine Production
The invention discloses a method for enhancing fatty acid degradation and glyoxylic acid cycle to increase threonine production, belonging to the field of genetic engineering and fermentation engineering technology. The method effectively improves threonine production by strengthening fatty acid degradation and weakening fatty acid synthesis, and accelerating glyoxylic acid cycle. The threonine yield of strain TWF044 constructed by the method of the present invention reaches 21.64g/L, which is 75% higher than that of the original strain and 75% higher than that of the original strain.
【技术实现步骤摘要】
一种强化脂肪酸降解和乙醛酸循环提高苏氨酸产量的方法
本专利技术涉及一种强化脂肪酸降解和乙醛酸循环提高苏氨酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程
技术介绍
作为8种必需氨基酸之一，L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。此外，L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂。苏氨酸的工业生产方法主要有蛋白水解、化学合成和微生物发酵。相对于前两种方法，发酵法优点是原料便宜、反应条件温和、环境污染小、效率高等。大肠杆菌由于其遗传背景清楚，基因操作简单，发酵周期短等优点，在工业生产饲料添加级苏氨酸中占主要地位。目前还没有利用生产菌株加强脂肪酸降解，削弱脂肪酸合成，生产苏氨酸的报道。出发菌株是工业化生产的高产苏氨酸菌株TWF006，基因编辑技术在菌株染色体上进行，在染色体上删除和插入多个相关基因，产量提高很高。由于目前苏氨酸生产高产菌是大肠杆菌，大肠杆菌虽生长迅速发酵周期短，但是转化率也并不高。该工业化生产的出发菌株，目前利用葡萄糖生产苏氨酸经济效益最好，但是转化率低，摇瓶作为对照时，转化率为40％。
技术实现思路
本专利技术目的在于提高该菌株的产量和转化率，并建立一种在大肠杆菌里高产苏氨酸的方法，同时这种方法可以运用到不同的产品生产。本专利技术第一个目的是提供一株高产苏氨酸的基因工程菌，所述菌株以具有苏氨酸生产能力的菌株为出发菌株，加强了脂肪酸降解途径、乙酸转化为乙酰辅酶A的途径、乙醛酸循环和苏氨酸合成途径。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌TWF006为出发菌株；所述TWF006公开于2018年的论文《Increasingl-threonineproductioninEscherichiacolibyengineeringtheglyoxylateshuntandthel-threoninebiosynthesispathway》。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是在大肠杆菌TWF006基因组上，缺失了lacI、fadR、fabR基因，替换了acs基因启动子为SEQIDNO.4所示的序列，并在lac操纵子位点插入fadBA、aceBA、thrA*BC、rhtC、aspC、ppc和ppnK基因。本专利技术的第二个目的是提供一种所述菌株的构建方法，所述方法是采用基因编辑技术，将出发菌株染色体上的基因lacI、fadR、fabR敲除；在基因组上替换acs基因启动子为Ptac-trc启动子；在菌株染色体上lac操纵子位点插入fadBA、aceBA、thrA*BC、rhtC、aspC、ppc和ppnK基因。在本专利技术的一种实施方法中，在基因组lac操纵子部位按照基因组序列标识方向依次插入一个拷贝的fadBA和aceBA基因，加强脂肪酸降解为乙酰辅酶A并快速进入乙醛酸被利用，减少了乙醛酸循环进入三羧酸循环，从而减少了碳源的丢失。在本专利技术的一种实施方法中，基因acs转录乙酰辅酶A合成酶，催化乙酸合成乙酰辅酶A，替换该基因启动子，能减少胞内乙酸的量，既解除了乙酸积累对细胞生长的抑制，也能将乙酸催化为乙酰辅酶A，作为底物进入乙醛酸循环。在本专利技术的一种实施方法中，来自于谷氨酸棒杆菌的基因ppnK被插入到基因组lacZ位点，位置在已经插入的基因fadBA和aceBA中间，催化NADH转化为NADPH，为苏氨酸合成途径提供充足的还原力。在本专利技术的一种实施方法中，lacA基因被基因簇thrA*BC-rhtC替换、lacZ位点还插入了基因aspC和ppc。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因aspC位于基因ppnK和aceBA中间；所述基因ppc位于基因簇thrA*BC-rhtC和基因aceBA之间，以加强苏氨酸合成。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因lacI的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因fadR的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因fabR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述Ptac-trc启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因fadBA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因aceBA的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因thrA*BC的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因rhtC的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因aspC的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因ppc的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因ppnK的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述acs基因启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。在本专利技术的一种实施方法中，基因编辑技术采用CRISPRCas9编辑系统。在本专利技术的一种实施方法中，敲除fadR基因，解除fadR基因编辑的蛋白FadR阻遏脂肪酸降解途径，同时使脂肪酸合成途径得以削弱，因此积累核心物质acetyl-CoA；敲除lacI可以解除其转录翻译的蛋白LacI对基因组上Ptrc和即将插入的Ptac-trc启动子的阻遏(出发菌株TWF006中，Ptrc控制基因aspC和操纵子aceBAK的转录)；敲除fabR可以部分恢复fadR敲除对不饱和脂肪酸合成的削弱效应，细胞膜形成得到部分恢复，由fadR敲除导致的细胞生长变慢得到恢复，细胞生长更快。综上，上诉三个基因的敲除，构建了一个加强脂肪酸降(敲除fadR后的效应)、削弱脂肪酸合成(敲除fadR后的效应)、细胞生长加快(敲除fabR后的效应)、通过乙醛酸循环快速利用脂肪酸降解产物acetyl-CoA(敲除lacI后的效应)的菌株。本专利技术还要求保护所述基因工程菌在制备赖氨酸、异亮氨酸或天冬氨酸中的应用。本专利技术的效果：(1)本专利技术构建的一株高产苏氨酸的菌株E.coliTWF044，构建过程的所有基因编辑都是在基因组上完成，遗传性能非常稳定，性状不丢失，应用时无需添加抗生素，适合工业化生产。(2)在工业化生产苏氨酸的菌株里面，加强脂肪酸降解和削弱脂肪酸合成，通过乙醛酸循环快速利用脂肪酸降解产物乙酰辅酶A的方法，能有效提高苏氨酸产量。应用本专利技术的方法构建的菌株TWF044的苏氨酸产量达到21.64g/L，与出发菌株本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株产苏氨酸的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，缺失了lacI、fadR、fabR基因，并在lac操纵子位点插入fadBA、aceBA、thrA*BC、rhtC、aspC、ppc和ppnK基因。
【技术特征摘要】
1.一株产苏氨酸的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，缺失了lacI、fadR、fabR基因，并在lac操纵子位点插入fadBA、aceBA、thrA*BC、rhtC、aspC、ppc和ppnK基因。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，将acs基因的启动子替换为Ptac-trc启动子。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌TWF006为出发菌株。4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述lacI、fadR、fabR基因分别含有SEQIDNO.1～3所示的核苷酸序列；所述fadBA、aceBA、thrA*BC、rhtC、aspC、ppc和ppnK基因分别含有如SEQIDNO.5～11所示的核苷酸序列。5.一种构建权利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，采用基因编辑技术，将出发菌株染色体上的基因lacI、fadR、fabR敲除，在菌株染色体上lac操纵子位点插入fadBA、aceBA、thrA*BC、rhtC、aspC、ppc和ppnK基因，并在基因组...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，杨俊，胡晓清，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。