绿脓杆菌的外膜蛋白质ＰＡ４７１０制造技术

本发明专利技术的课题是提供具有实质性地预防或治疗绿脓杆菌感染的能力、且能够作为应对来自绿脓杆菌感染患者的临床分离株的多样性的疫苗组合物使用的蛋白质抗原或肽抗原，以及针对该抗原的抗体。本发明专利技术提供用于与绿脓杆菌相关的疾病的诊断、预防或治疗的蛋白质抗原或肽抗原以及针对这些抗原的抗体。根据本发明专利技术，提供了用于与绿脓杆菌相关的疾病的诊断、预防或治疗的来自绿脓杆菌的外膜蛋白质ＰＡ４７１０的蛋白质或肽，以及针对它们的抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来自绿脓杆菌外膜蛋白质PA4710的蛋白质抗原或肽抗原，以及针对 该抗原的抗体。本专利技术还涉及含有该抗原的疫苗组合物。本专利技术进一步涉及含有该抗体的 药物组合物、绿脓杆菌感染症诊断剂、绿脓杆菌感染症治疗剂、绿脓杆菌的检测试剂盒。
技术介绍
绿脓杆菌(铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))是在土壤、水中等自然环 境中广泛分布的革兰氏阴性杆菌，引发难治性的严重致死性感染症。绿脓杆菌的主要感染 目标是包括烧伤、脏器移植或癌症患者的一般被称为受累宿主(compromised host)的生物 体防御功能衰弱的易感染性患者，绿脓杆菌是造成院内感染的主要病原菌。而且该菌所造 成的肺感染症对囊性纤维化病患者是致死性的。虽然可以对这些患者主要施用具有抗绿脓 杆菌活性的抗菌剂，但较多病例由于绿脓杆菌的抗药性而得不到充分的治疗效果。另外，对 于针对绿脓杆菌的疫苗、抗体也长期进行了研究，但是在直接使用灭活菌的方法中，存在必 须根据绿脓杆菌的血清型不同而分别制备各种疫苗、抗体等缺点。在这种情况下，人们期待通过使用在绿脓杆菌之间具有共同的氨基酸序列的来自 绿脓杆菌的蛋白质进行主动免疫或被动免疫，来预防或治疗绿脓杆菌感染症。作为将来自 绿脓杆菌的蛋白质应用于疫苗的例子，已知融合了外膜蛋白质OprF和OprI的一部分的重 组蛋白质(特开平8-245699号公报文献1)、IV型菌毛蛋白质(W02004/099250号公报 文献2)等。另外，关于以来自绿脓杆菌的蛋白质为靶标的抗体药物，已经报告了抗IV型菌毛 蛋白抗体(文献2)、抗PA1706(或PcrV)抗体(US6309651号公报文献3、US6827935号公 报文献4)、抗PA5158抗体(W02007/049770号公报文献5)等。但是，因为显示多种血清型的绿脓杆菌临床分离株所共同具有的来自菌体的蛋白 质可以作为“绿脓杆菌共同抗原”而用于绿脓杆菌感染症的预防、诊断或治疗，所以人们经 常寻求这种蛋白质。可是，PA4710(或 phuR)基因(Genebank 登录号 AF055999)所编码的 PA4710 (又 名PhuR)蛋白质，属于TonB依赖性受体家族，是构成绿脓杆菌的血红素吸收系统的外膜 氯高铁血红素受体蛋白质(Microbiology, 2000,146，185-198 文献 6 ；Environmental Microbiology，2003，5，1350-1369 文献7)。TonB依赖性受体包括由22个横跨外膜的折叠股构成的外膜桶(0-barrel)和栓结构域(plug domain) 0栓结构域从周质 侧进入桶内，形成栓形状。一旦配体结合，TonB依赖性受体就发生构象变化，从而将 配体摄入周质。利用TonB依赖性受体的配体摄入需要能量。该能量是通过存在于内膜的 由3个蛋白质TonB-ExbB-ExbD形成的能量转换复合体，经由TonB蛋白质与延伸至TonB 依赖性受体的氨基末端的TonB框(TonBbox)相互作用来供给的。仅有唯一的D-Squared Biotechnologies, Inc.公开了 PA4710蛋白质的部分序列可以作为疫苗的成分利用、并且 由该蛋白产生的抗体组合物可以作为感染症治疗药或诊断药利用的内容，但其中没有实施例，仅从广泛的菌种之间铁吸收系统蛋白质的同源性出发进行了描述(W02002/083843号 公报文献8 ；W02003/006672号公报文献9)。
技术实现思路
本专利技术的课题是提供具有实质性地预防或治疗绿脓杆菌感染的能力、且能够作为 应对来自绿脓杆菌感染患者的临床分离株的多样性的疫苗组合物使用的蛋白质抗原或肽 抗原，以及针对该抗原的抗体。本专利技术者们为了解决上述课题，尝试了从绿脓杆菌的外膜蛋白质中探索新型、有 用的“绿脓杆菌共同抗原”，进行了各种研究，结果通过基因芯片(GeneChip)分析发现，编 码位于绿脓杆菌的外膜的PA4710(又名PhuR)蛋白质的基因无论是否存在人血清，都能够 稳定表达(实施例1)。另外，通过对于67株绿脓杆菌临床分离株进行基因分析，成功鉴 定了 PA4710蛋白质中氨基酸序列保守的区域，同时在该氨基酸序列保守的区域中，特定了 PA4710蛋白质的11个细胞外区域(实施例2、9)。进而，本专利技术者们发现，免疫PA4710重组蛋白质或位于其氨基酸序列保守的区域 内的细胞外区域的肽所得到的抗血清或抗体，与PA4710蛋白质结合，也与绿脓杆菌的菌体 表面结合(实施例7、8)。另外，确认了该抗体在绿脓杆菌感染模型小鼠中显示高抗感染效 果(实施例10 12)。S卩，本专利技术者们通过对PA4710蛋白质的全长区域进行详细的分析，成功地压缩出 PA4710蛋白质的免疫优势区域，同时发现针对该区域的抗体在绿脓杆菌感染模型小鼠中显 示高抗感染效果，从而完成了本专利技术。本专利技术更详细地说，涉及以下专利技术。<1> 选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)的蛋白质(i)含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸 的氨基酸序列，且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；(iii)由与编码序列号4所示氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷 酸编码、且与由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和(iv)含有与序列号4所示氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列、且与由 序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。<2>由下述氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列包含在选自序列号3所示氨基 酸序列中的181位 198位、204位 257位、259位 311位、313位 319位、321位 436位、440位 491位、493位 600位、602位 764位中的氨基酸序列中，且该肽编码从 绿脓杆菌的表面露出的肽区域。<3>由<2>所述的肽的氨基酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组 成的肽。<4>由序列号5 15的任一项所示氨基酸序列组成的肽。<5>由<4>所述的肽的氨基酸序列中具有1个或数个保守性置换的氨基酸序列组 成的肽。<6>由含有<2>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组成的肽。<7>由含有<3>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。<8>由含有<4>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。<9>由含有<5>所述的肽的氨基酸序列中连续的至少7个氨基酸的氨基酸序列组 成的肽。<10>针对来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质或其一部分的抗体或其功能性片段。<11>如<10>所述的抗体或其功能性片段，来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的一部 分是来自绿脓杆菌的PA4710蛋白质的含有细胞表面环的区域。<12>针对<1>所述的蛋白质的抗体或其功能性片段。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
选自以下（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）和（ｉｖ）的蛋白质：（ｉ）含有序列号４所示氨基酸序列的蛋白质；（ｉｉ）含有序列号４所示氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了１个或多个氨基酸的氨基酸序列，且与由序列号４所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；（ｉｉｉ）由与编码序列号４所示氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且与由序列号４所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；和（ｉｖ）含有与序列号４所示氨基酸序列具有７０％以上同一性的氨基酸序列、且与由序列号４所示氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：田中二朗，长曾宏，熊谷正志，大塚圭子，赤羽宏友，铃木贵久，
申请(专利权)人：明治制果株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]