一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌，属于工程菌的构建和应用技术领域，所述基因工程菌以Xanthomonas campestris NK‑01为出发菌株，在所述出发菌株中敲除乙酰基转移酶Ⅰ基因gumF和乙酰基转移酶Ⅱ基因gumG，并且过表达酮基转移酶基因gumL；所述Xanthomonas campestris NK‑01的菌种保藏编号为CGMCC No.15155。所述基因工程菌生产的黄原胶在水溶液或者盐溶液中均呈现凝胶态，凝胶强度随着黄原胶浓度和离子浓度的增加而增加；比自然产生的黄原胶具有更加优越的增稠和凝胶特性，且不受发酵条件的限制，可稳定高效生产，具有广泛的工业应用前景。

A GENE ENGINEERING STRAIN PRODUCING GEL XANTHAN GUM AND ITS CONSTRUCTION METHOD AND APPLICATION

The invention provides a genetic engineering bacteria for producing gelatinous xanthan gum, belonging to the construction and application technology field of Engineering bacteria. The genetic engineering bacteria take Xanthomonas campestris NK 01 as the starting strain, knock out the gumF and gumG genes of acetyltransferase I and acetyltransferase II in the starting strain, and overexpress the gumL gene of ketyltransferase. The preservation number of campestris NK_01 is CGMCC No. 15155. Xanthan gum produced by genetically engineered bacteria showed gel state in aqueous solution or salt solution. The gel strength increased with the increase of xanthan gum concentration and ionic concentration. It had more excellent thickening and gel properties than natural produced xanthan gum, and was not restricted by fermentation conditions. It could produce stably and efficiently, and had extensive industrial application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌株及其构建方法和应用
本专利技术属于工程菌的构建和应用
，尤其涉及一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)产生的一种胞外阴离子多糖，是国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能最优越的生物胶，已广泛应用于食品、农业、石油、印染及日化等行业。我国是黄原胶的重要生产基地，黄原胶产量约占全球总产量的67％。近几年全球对黄原胶的需求逐年上涨，我国黄原胶产量也一直呈现增长趋势。随着黄原胶应用领域的不断扩展以及下游产业对产品质量要求的提升，开发具有稳定优良特性的黄原胶产品是工业发展的一大趋势。黄原胶具有类似纤维素的骨架结构，且在第二个葡萄糖上含有α-D-Man-(2→1)-β-D-GlcA-(4→1)-β-D-Man的侧链结构。根据不同的黄原胶生产菌株及发酵条件，接近90％的内侧甘露糖发生乙酰化，而30～50％的外侧甘露糖基团发生丙酮酸化。侧链上的乙酰基团可以稳定分子内部的螺旋构象，而丙酮酸基团可以促进黄原胶分子间的交联，因此，丙酮酸含量越高，黄原胶溶液的粘度越大。根据黄原胶的单体类型，丙酮酸含量在黄原胶分子中所占的最大比例为8.69％，而自然存在的黄原胶中丙酮酸含量一般低于5.0％。黄原胶分子中丙酮酸和乙酰基含量的差异可显著影响黄原胶的流变学特性。在传统发酵过程中，由于发酵条件、出发菌株、发酵批次的不同，黄原胶分子中丙酮酸和乙酰基含量存在差异，进而影响了黄原胶的流变学特性。这一现状对黄原胶产品的质量分析、分选造成了困扰，并增加了黄原胶的生产成本及不稳定性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌及其构建方法和应用；所述基因工程菌产生的黄原胶具有饱和的丙酮酸含量，低浓度下即可形成弱凝胶，产品质量及流变学特性稳定。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌，所述基因工程菌以XanthomonascampestrisNK-01为出发菌株，在所述出发菌株中敲除乙酰基转移酶Ⅰ基因gumF和乙酰基转移酶Ⅱ基因gumG，并且过表达酮基转移酶基因gumL；所述XanthomonascampestrisNK-01的菌种保藏编号为CGMCCNo.15155。优选的，所述过表达酮基转移酶基因gumL是通过向所述出发菌株中转入包含酮基转移酶基因gumL的多拷贝表达质粒pBBRL实现。本专利技术提供了所述的基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：1)敲除所述出发菌株中的gumF基因和gumG基因，获得gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)；2)在步骤1)中所述的gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)中过表达酮基转移酶基因gumL获得基因工程菌。优选的，步骤1)中敲除所述出发菌株中的gumF基因和gumG基因包括以下步骤：1.1)以所述出发菌株的基因组为模板，进行PCR扩增获得基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段；所述基因gumF的上游同源臂片段的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；所述基因gumG的下游同源臂片段的核苷酸序列如SEQIDNo：2所示；1.2)将步骤1)获得的所述基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段通过overlapPCR重组后，连接至自杀质粒pLO3中，获得无痕敲除质粒plO3-FG；1.3)将步骤2)中所述无痕敲除质粒plO3-FG转入出发菌株中进行gumF和gumG基因的敲除获得gumF和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)。优选的，步骤2)中所述过表达酮基转移酶基因gumL包括以下步骤：2.1)将酮基转移酶基因gumL与载体pBBR1mcs-2连接获得多拷贝表达质粒pBBRL；2.2)将步骤2.1)中所述多拷贝表达质粒pBBRL转入到所述gumF和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)中获得基因工程菌XC(△FG::pBBRL)。优选的，步骤1.3)中所述的转入为接合转移，所述出发菌株和无痕敲除质粒plO3-FG的数量比为1：(1.5～2.5)；所述接合转移的温度为28～32℃，所述接合转移的时间为8～12h。本专利技术提供了一种利用所述基因工程菌生产黄原胶的方法，包括以下步骤：S1)将所述基因工程菌接种到种子培养基中进行活化获得活化菌液；S2)将所述活化菌液接种到发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液；所述发酵培养的温度为28～32℃，所述发酵培养的时间为60～84h；S3)醇沉所述发酵液，收集固相组分为黄原胶。优选的，步骤S1)中所述活化菌液的菌浓度OD600为0.4～0.6。优选的，步骤S2)中所述活化菌液的接种量为8～12％(V/V)。优选的，所述发酵培养的培养基以1L计，包括以下组分：玉米淀粉，40～60g；鱼蛋白胨，3.5～4.5g；碳酸钙，3.5～4.5g和余量的水。本专利技术的有益效果：本专利技术所述生产凝胶态黄原胶的基因工程菌，以XanthomonascampestrisNK-01为出发菌株，敲除了所述出发菌株中的乙酰基转移酶Ⅰ基因gumF和乙酰基转移酶Ⅱ基因gumG，并过表达了酮基转移酶基因gumL；所述基因工程菌生产的黄原胶具有更高的丙酮酸含量，接近于饱和；在低浓度条件下即为弱凝胶，随着浓度的增加，零剪切粘度和储能模量逐渐增加，当达到2％浓度后，黄原胶呈现较强的凝胶态，具有一定的自持性。所述基因工程菌生产的黄原胶在水溶液或者盐溶液中均呈现凝胶态，凝胶强度随着黄原胶浓度和离子浓度的增加而增加；比自然产生的黄原胶具有更加优越的增稠和凝胶特性，且不受发酵条件的限制，可稳定高效生产。因此，本专利技术所述基因工程菌株具有广泛的工业应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1中gumF和gumG基因的敲除流程图；图2为缺失菌株的PCR验证图，其中M为DNAMarkerDL2000，泳道W为出发菌株的PCR结果，泳道Δ为gumF和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)的PCR结果；图3为实施例3不同黄原胶产品的粘度随剪切力变化曲线图；图4为实施例3中不同浓度的黄原胶XC-L的粘度(a)和模量(b)变化曲线；图5为黄原胶XC-L在不同NaCl浓度下的粘度(a)和模量(b)变化曲线；图6为黄原胶XC-L的凝胶态观察，a指不同浓度的XC-L的凝胶态，b指1.0％的XC-L在不同浓度Na+中的凝胶态；照片于倒置12小时后拍摄；图7为黄原胶XC-L(a)和XC-5(b)在NaCl溶液中的显微结构及高度线图，a图中1和2代表多螺旋链，b图中1-3代表双螺旋链；图8为质粒pLO3的质粒图谱。生物保藏说明野油菜黄单胞菌XanthomonascampestrisNK-01保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2018年01月03日，保藏编号为CGMCCNo.15155。具体实施方式本专利技术提供了一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌，所述基因工程菌以XanthomonascampestrisNK-01为出发菌株，在所述出发菌株中敲除乙酰基转移酶Ⅰ基因gumF和乙酰基转移酶Ⅱ基因gumG，并且过表达酮基转移酶基因gumL；所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以Xanthomonas campestris NK‑01为出发菌株，在所述出发菌株中敲除乙酰基转移酶Ⅰ基因gumF和乙酰基转移酶Ⅱ基因gumG，并且过表达酮基转移酶基因gumL；所述Xanthomonas campestris NK‑01的菌种保藏编号为CGMCC No.15155。

【技术特征摘要】
1.一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以XanthomonascampestrisNK-01为出发菌株，在所述出发菌株中敲除乙酰基转移酶Ⅰ基因gumF和乙酰基转移酶Ⅱ基因gumG，并且过表达酮基转移酶基因gumL；所述XanthomonascampestrisNK-01的菌种保藏编号为CGMCCNo.15155。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述过表达酮基转移酶基因gumL是通过向所述出发菌株中转入包含酮基转移酶基因gumL的多拷贝表达质粒pBBRL实现。3.权利要求1或2所述的基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：1)敲除所述出发菌株中的gumF基因和gumG基因，获得gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)；2)在步骤1)中所述的gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)中过表达酮基转移酶基因gumL获得基因工程菌。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中敲除所述出发菌株中的gumF基因和gumG基因包括以下步骤：1.1)以所述出发菌株的基因组为模板，进行PCR扩增获得基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段；所述基因gumF的上游同源臂片段的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；所述基因gumG的下游同源臂片段的核苷酸序列如SEQIDNo：2所示；1.2)将步骤1)获得的所述基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段通过overlapPCR重组后，连接至自杀质粒pLO3中，获得无痕敲除质粒plO3-FG；1.3)将步骤2)中所述无痕敲除质...

【专利技术属性】
技术研发人员：马挺，吴萌萌，李国强，史忠，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12