本发明专利技术公开了脐带间充质干细胞在治疗肝病方面生物学效力的评价方法，当人脐带间充质干细胞的第3代表达肝细胞生长因子的mRNA水平Ct值减去内参基因GAPDH的Ct值得到的差值大于7.95时判定第3代的人脐带间充质干细胞在治疗肝病方面生物学效力不合格。采用本发明专利技术的检测方法检测时样本处理简便，利用商品化的RNA提取试剂盒，可以在2个小时内完成检测。
Evaluation of biological efficacy of umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of liver diseases
The present invention discloses an evaluation method of biological efficacy of umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of liver diseases. When the difference between CT value of the third generation of human umbilical cord mesenchymal stem cells representing the level of hepatocyte growth factor and CT value of GAPDH is greater than 7.95, it is determined that the biological efficacy of the third generation of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of liver diseases is not qualified. Sample processing is simple when using the detection method of the present invention, and the detection can be completed within 2 hours by using the commercialized RNA extraction kit.
【技术实现步骤摘要】
脐带间充质干细胞在治疗肝病方面生物学效力的评价方法
本专利技术涉及干细胞疾病特异性定向应用的基因表达筛选检测技术，具体地说，涉及一种脐带间充质干细胞治疗肝病方面生物学效力的检测方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞(umbilicalcord-mesenchymalstemcells，UC-MSCs)是从脐带组织中分离得到的一种具有多向分化潜能和多种生物学功能的成体干细胞。脐带来自于胎儿生产后的废弃物，脐带的获取具有天然的优势，因为脐带和胎盘在我国均属于医疗废弃物，而且对捐赠者(供体)没有额外的创伤，没有医学伦理的困扰。和人体其他的组织部位如骨髓和脂肪等相比，从脐带中获取MSCs具有多个优势，包括来源丰富、MSCs比例高、MSCs的增殖能力强、更低的免疫原性、更强的免疫抑制能力、对供体不存在创伤等。MSCs能分泌更多的营养性生长因子，比如肝细胞生长因子等，非常有利于MSCs发挥组织器官修复的功能。已经证明肝细胞生长因子(HGF)是促进肝细胞增殖和肝再生的最强效细胞因子。HGF刺激肝干/祖细胞的增殖来修复肝损伤。HGF还可引起Bcl-xL的强烈表达，阻断Fas及其配体激活后的信号传导，进而抑制Fas介导的肝细胞凋亡，从而治疗Fas引起的爆发性肝衰竭。HGF除了能诱导肝实质细胞的迅速增殖外，还能刺激胆管上皮细胞增殖，因而影响整个器官的发育。由于HGF有促进肝细胞增殖和抑制凋亡的特性，使得HGF可能是肝病细胞治疗的一个关键因子。我们和其他的研究小组都发现MSCs分泌高水平的HGF。由于脐带来源的MSCs比骨髓来源的MSCs分泌更高的HGF，这可以解释同样是MSCs临床治疗乙肝慢加急性肝衰竭，但是脐带MSCs治疗的效果明显优于骨髓MSCs的治疗效果，明显提高肝衰竭患者的生存率。另外，研究发现MSCs在抑制免疫反应的同时，具有消除炎症的功能。因此，MSCs具有重要的研究和应用前景，特别在治疗肝病疾病方面均具有重要的临床应用价值。目前，对MSCs只有一个广泛性的定义，即2006年国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞定义的三个标准，而缺乏治疗功能性的定义，没法判断经过培养的MSCs更合适针对某一类疾病，也缺少疾病相关性的生物学效力的判断。随着研究的加深，逐渐认识到不同个人来源的MSCs很可能存在治疗功能上的强弱之分，也缺乏有效而快捷的具有针对性的生物学效力检测手段。因此，为了克服以上问题的不足，我们对脐带来源的MSCs在肝细胞生长因子(HGF)基因表达层进行了系统研究，通过大样本检测来总结分析比对数据，证明HGF的表达，在不同个体种存在明显的差异，而且在不同的培养代数方面亦存在不同的差异。据此，我们提出了一种检测MSCs在肝病特异性定向应用的基因表达层面筛选的新方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有间充质干细胞在治疗肝病方面的生物学效力检测手段的不足，建立一套有效检测脐带间充质干细胞治疗肝病潜能的新方法。本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞生物学效力的检测方法，其特征在于通过检测脐带间充质干细胞的HGF-mRNA的表达量来判断其治疗肝病的效力。在一个特定的实施方案中，所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，并且其判断标准为：实时定量PCR方法检测人脐带间充质干细胞的HGF基因mRNA的表达量以差值为7.95(差值＝CtHGF-CtGAPDH)为阈值，高于此数值的判定为人脐带间充质干细胞治疗肝病的效力不合格。本专利技术所用的计算公式，即差值＝CtHGF-CtGAPDH为一次ΔCt法，因为只需要HGF的Ct值和自己的内参基因(GAPDH)相比，得出这批MSCs的HGF的表达水平相对于内参基因的表达水平的差异即可。由于不涉及HGF的表达基因和其他的表达基因相比较，也不涉及MSCs处理前后的HGF的表达基因相比较，故本专利技术无需采用两次ΔCt法。本专利技术首次采用多样本检测不同细胞培养代数的脐带MSC的HGF-mNRA，通过统计学方法，利用SPSS软件，计算出32个不同脐带来源的MSCs在P3代时HGF的mRNA相对表达量水平的95％置信区间。由于MSCs分泌的HGF越高越好，因为本次专利技术采用了95％置信区间的下限值为阈值，低于此阈值，则判断为这批MSCs不适合用来治疗肝病。本专利技术所达到的有益效果是：采用本专利技术的检测方法检测时样本处理简便，利用商品化的RNA提取试剂盒，可以在2个小时内完成检测。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是32个不同脐带来源的MSC，HGF的mRNA和内参GAPDH的mRNA相比较后的数据；图2是随机选取32个不同来源的脐带MSC中的6个样本，然后从P3代继续培养到P20代，在P3、P6、P10、P15、P20代时，分别继续实时定量PCR方法检测MSCs的HGF相对表达量。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例总RNA的提取和逆转为cDNA一共收集了32条脐带，从脐带中分离出MSC，从原代培养至第三代后，在超净台环境下消化，然后用PBS离心洗涤2次，用商品化的RNA提取试剂盒(Invitrogen公司的产品)提取出MSCs的总RNA，Nanodrop检测总RNA的260/280OD值。根据OD值，利用逆转录试剂盒(Promega公司的产品)把mRNA逆转录为cDNA片段。实时定量PCR检测HGF的mRNA相对表达量引物名称序列GAPDH-S5'TCGACAGTCAGCCGCATCT3'GAPDH-A5'CCGTTGACTCCGACCTTCA3'HGF-S5'AGTGGCATCAAATGTCAGCC3'HGF-A5'GCTTGTGAAACACCAGGGTC3'实时定量PCR仪为ABI公司的7500型号，耗材和试剂均购自ABI公司。经过实时定量PCR检测后，32个样本来源的MSCs在P3代时，HGF基因和GAPDH基因的检测值(Ct值)如下。编号12345678910GAPDH16.24115.81815.6216.76116.46215.31314.98515.64915.80315.945HGF23.58624.0723.525.01126.40123.39322.64822.97822.97523.263编号11121314151617181920GAPDH15.33314.68116.00414.92215.17115.21314.9415.47715.02314.661HGF22.91922.32523.38221.78222.70922.65922.20823.60421.76123.445编号21222324252627282930GAPDH15.26814.90314.2515.35314.89515.92513.97114.11414.61415.47HGF24.00623.33320.87522.89221.36722.31322.06422.42722.02122.515编号3132GAPDH14.60415.065HGF22.85522.127数据的处理和统计分析根据基因表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.脐带间充质干细胞在治疗肝病方面生物学效力的评价方法，其特征在于，通过检测脐带间充质干细胞表达肝细胞生长因子的mRNA水平来评价其治疗肝病的能力。
【技术特征摘要】
1.脐带间充质干细胞在治疗肝病方面生物学效力的评价方法，其特征在于，通过检测脐带间充质干细胞表达肝细胞生长因子的mRNA水平来评价其治疗肝病的能力。2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞在治疗肝病方面生物学效力的评价方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，检测的细胞代数为第3代。3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞在治疗肝病方面生物...
【专利技术属性】
技术研发人员：王汉裕，钦威，穆飞飞，
申请(专利权)人：常州诺赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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