本发明专利技术公开了一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法，本发明专利技术通过设计FASN基因特异性引物对，内参引物GAPDH的qPCR扩增，以及对qPCR结果的相对定量分析，准确、快速地分析了FASN基因在牛肌肉中的表达情况。本发明专利技术所建立的检测FASN基因表达水平的qPCR检测方法，可用于精确检测不同品种牛肌肉FASN基因的表达水平。该发明专利技术所述方法可用于检测不同品种牛肌肉FASN基因的表达水平，对深入研究牛FASN基因功能提供参考，方法简便，易操作。
A Method for Detecting FASN Gene Expression in Bovine Muscle
The invention discloses a method for detecting the expression of FASN gene in bovine muscle. The expression of FASN gene in bovine muscle is accurately and rapidly analyzed by designing specific primer pairs of FASN gene, qPCR amplification of internal reference primer GAPDH and relative quantitative analysis of qPCR results. The qPCR method for detecting the expression level of FASN gene established by the invention can be used for accurately detecting the expression level of FASN gene in different breeds of cattle muscle. The method described in this invention can be used to detect the expression level of FASN gene in different breeds of cattle muscle, and provide reference for further study of the function of FASN gene in cattle. The method is simple and easy to operate.
【技术实现步骤摘要】
一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别指一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法。
技术介绍
脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase，FASN)是由6种酶组成的多酶复合体系，FASN是脂肪合成限速酶，其活性高低直接控制着体内脂肪的合成。在哺乳动物体内，二聚体形式存在的FASN才具有催化脂肪酸合成的活性，单体形式FASN不具备催化脂肪酸合成的活性，但FASN的部分功能域在单体中仍然拥有催化活性，然而对于需要提前将底物转移至酰基载体蛋白(Acylcarrierprotein，ACP)功能区并且与ACP相互作用的功能域活性降低。利用原位杂交和体细胞杂交的方法，将牛的FASN基因定位于19号染色体上，DNA序列全长19.7Kb，cDNA序列全长7542bp，编码2513个氨基酸。相对于其他组织FASN基因在肝脏、泌乳期乳腺和脂肪等组织表达活性较高，同时FASN基因表达活性也受动物体内相关激素的调控，比如甾醇、催乳素可提高其表达效果，而胰岛素、孕酮可下调其表达效果。另外，日粮中高碳水化合物和脂肪可影响肝脏FASN的合成。在胰岛素和肾上腺糖皮质激素的协同作用下，高碳水化合物日粮可以增加肝脏FASN的合成；而脂肪可以抑制肝脏FASN基因的表达。目前关于该基因在牛肌肉上的报道较少。因此需要开发一种能够准确检测牛肌肉FASN基因表达量的方法，以便于其在肉品质研究中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法，具体包括以下步骤：1)从待检测的牛肉组织中提取总RNA，再通过反转录反应制备cDNA样品；2)将制备的cDNA样品进行荧光定量实时PCR检测，内参基因GAPDH的qPCR扩增反应体系为：RremixExTaqTMII(PerfectReaLTime)10.0μL，ddH2O8μL，G-F0.5μL，G-R0.5μL，牛的肌肉组织cDNA1.0μL；牛FASN基因的qPCR扩增反应体系为：RremixExTaqTMII10.0μL，ddH2O8μL，F-F0.5μL，F-R0.5μL，牛肌肉组织cDNA1.0μL；3)在定量PCR仪上进行检测，荧光信号在每个循环结束时检测，每个样品3个重复，计算牛FASN基因的表达量。在上述技术方案中，所述的引物对F-F和F-R的序列为：F-F：5’-ATCGAGTGCATCAGGCAAGT-3’，见序列表SEQNO.1。F-R：5’-TGTGAGCACATCTCGAAAGCCA-3’，见序列表SEQNO.2。在上述技术方案中，所述的引物对G-F和G-R的序列为：G-F：5’-CGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTG-3’，见序列表SEQNO.3。G-R：5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCT-3’，见序列表SEQNO.4。在上述技术方案中，所述内参基因GAPDH和牛FASN基因的qPCR扩增反应程序相同，均为：95℃预变性30sec，95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸20sec，40个循环。在上述技术方案中，所述G-F、G-R、F-F和F-R的浓度均为20μmol/L。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过设计FASN基因特异性引物对，内参引物GAPDH的qPCR扩增，以及对qPCR结果的相对定量分析，准确、快速地分析了FASN基因在牛肌肉中的表达情况。本专利技术所建立的检测FASN基因表达水平的qPCR检测方法，可用于精确检测不同品种牛肌肉FASN基因的表达水平。该专利技术所述方法可用于检测不同品种牛肌肉FASN基因的表达水平，对深入研究牛FASN基因功能提供参考，方法简便，易操作。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法，具体步骤如下：1)设计FASN基因序列的特异性引物对F-F和F-R和内参基因引物对G-F和G-R：参考Genbank收录的FASN基因序列(GenbankAccessionNo.NM-001012669)，内参基因GAPDH(GenbankAccessionNo.0NM-001034034)，利用PrimerPremier3.0软件设计引物，并通过NCBI中Blast功能，检测引物的特异性。F-F：5’-GTGAAGCCCATTGAGGACAT-3’，见序列表SEQNO.1。F-R：5’-AGCTGCACGTGTTCTGTCAC-3’，见序列表SEQNO.2。所述的引物对G-F和G-R的序列为：G-F：5’-CGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTG-3’，见序列表SEQNO.3。G-R：5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCT-3’，见序列表SEQNO.4。2)提取待测牛的肌肉组织总RNA并合成组织cDNA；样品采集：3岁蒙古牛和西门塔尔牛各6头，屠宰后采集各试验牛左侧胴体第12至第13肋骨处的背最长肌，液氮冷冻后放于-80℃冰箱保存备用。牛肌肉组织总RNA的提取采用ThermoFisherScientific公司的总RNA提取盒(TRIzolTMReagent)提取，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总RNA浓度通过NanoDrop2000微量紫外分光光度计测定。总RNA使用Takara逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRTMasterMix)进行逆转录成组织cDNA。3)以待测牛的肌肉组织cDNA为模板，以1)所述的引物对G-F和G-R为引物，qPCR扩增内参基因GAPDH；以待测牛的肌肉组织cDNA为模板，以1)所述的引物对F-F和F-R为引物，qPCR扩增牛FASN基因；其中，内参基因GAPDH的qPCR扩增反应体系为：RremixExTaqTMII(PerfectReaLTime)10.0μL，ddH2O8μL，G-F0.5μL，G-R0.5μL，牛的肌肉组织cDNA1.0μL；牛FASN基因qPCR扩增反应体系为：RremixExTaqTMII10.0μL，ddH2O8μL，F-F0.5μL，F-R0.5μL，牛肌肉组织cDNA1.0μL；其中，G-F、G-R、F-F和F-R的浓度均为20μmol/L；内参基因GAPDH和牛FASN基因的qPCR扩增反应程序相同，均为：95℃预变性30sec，95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸20sec，40个循环。其中，为了确保内参基因的准确度，上述两个扩增反应体系中G-F、G-R、F-F和F-R的浓度均为10μmol/L；上述两个扩增反应体系中，RremixExTaqTMII(PerfectReaLTime)也完全相同，均购自宝生物工程(大连)有限公司。内参基因GAPDH和牛FASN基因的qPCR扩增反应程序相同，均为：95℃预变性30sec，95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸20sec，40个循环。其中，按照Takara公司生产的RremixExTaqTMII(PerfectReaLTime)荧光定量试剂盒的说明本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：1)从待检测的牛肉组织中提取总RNA，再通过反转录反应制备cDNA样品；2)将制备的cDNA样品进行荧光定量实时PCR检测，内参基因GAPDH的qPCR扩增反应体系为：
【技术特征摘要】
1.一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：1)从待检测的牛肉组织中提取总RNA，再通过反转录反应制备cDNA样品；2)将制备的cDNA样品进行荧光定量实时PCR检测，内参基因GAPDH的qPCR扩增反应体系为：RremixExTaqTMII10.0μL，ddH2O8μL，G-F0.5μL，G-R0.5μL，牛的肌肉组织cDNA1.0μL；牛FASN基因的qPCR扩增反应体系为：RremixExTaqTMII10.0μL，ddH2O8μL，F-F0.5μL，F-R0.5μL，牛肌肉组织cDNA1.0μL；3)在定量PCR仪上进行检测，荧光信号在每个循环结束时检测，每个样品3个重复，计算牛FASN基因的表达量。2.根据权利要求1所述的一种检测牛肌肉FASN基因表达量的方法，其特征在于：所述引物对G-F和G-R的序列为：G...
【专利技术属性】
技术研发人员：敖日格乐，斯木吉德，王纯洁，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15
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