一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体，该干扰载体以pre‑amiR‑OsAGO17

An Artificial MicroRNA Interference Vector and Its Construction Method and Application

The invention discloses an artificial microRNA interference vector for rice OsAGO17 gene, which uses pre_amiR_OsAGO17 as interference vector.

【技术实现步骤摘要】
一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种人工microRNA干扰载体及其构建方法和应用。
技术介绍
Zeng(2002)和Guo(2005)等研究发现改变microRNA序列的几个核苷酸不会影响microRNA的产生和成熟。这一发现就使得在机体内产生人工合成的microRNA(artificialmicroRNA，amiRNA)这一理论成为现实。目前，amiRNA介导的基因沉默这一策略已被广泛的应用于动植物中。2002年，Zeng等首次成功的将amiRNA技术应用于人类细胞中；随后Parizotto等又将这一技术运用于拟南芥，并证实了amiRNA可以有效的抑制报告基因的表达。随后的研究表明，amiRNA不仅可以沉默报告基因还可以靶向内源基因，目前这一策略已在多种物种中得到验证。另外，无论是表达组成性的还是组织特异性的启动子都可以有效的表达amiRNA，且amiRNA和内源microRNA一样，都能高效的发挥作用。与常规的RNAi相比，amiRNA策略具有许多优点。RNAi策略中的茎环结构会产生多种不同siRNA，而microRNA的前体一般只产生一种有效的microRNA，这就使得amiRNA策略能够较为精确的预测潜在的脱靶现象；由于amiRNA的长度只有21nt，不易与内源基因发生同源重组，在生物安全方面优于RNAi；据报道，siRNA介导的基因沉默在低温条件下会被打破，Niu等研究发现amiRNA策略即使在低温条件下也能高效的介导基因沉默，这也使得amiRNA介导的基因沉默在稳定性和可靠性方面都得到人们的认可。
技术实现思路
为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：提供一种针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体，干扰载体包括pre-amiR-OsAGO17159序列，所述pre-amiR-OsAGO17159序列如SEQIDNo:7所示。本专利技术中在构建人工microRNA干扰载体时所用到的表达载体为pHB质粒。本专利技术中干扰载体的构建方法包括以下步骤：(1)根据osa-miR159a序列，设计合成引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，再以水稻DNA为模板进行PCR扩增，得pre-miR159a片段；所述pre-miR159a-F和pre-miR159a-R引物的序列分别如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示，所述pre-miR159a片段的序列如SEQIDNo:3所示；(2)设计特异靶向水稻OsAGO17基因的amiRNA，并从中筛选出替代pre-miR159a中miR159a序列后仍能保持pre-miR159a原二级结构的amiRNA，所筛选出的amiRNA为amiR-OsAGO17，其序列如SEQIDNo:4所示；再根据amiR-OsAGO17的序列设计用于检测人工microRNA表达的带生物素标记的探针amiR-OsAGO17*，其序列如SEQIDNo:8所示；(3)根据pre-miR159a序列和amiR-OsAGO17序列，设计合成带酶切位点的引物pre-amiR-OsAGO17159-F和pre-amiR-OsAGO17159-R，它们的序列分别如SEQIDNo:5和SEQIDNo:6所示；(4)利用步骤(3)中的引物，以pre-miR159a质粒为模板进行PCR扩增，再将pre-miR159a中成熟miR159a/miR159a*的序列替换成amiR-OsAGO17/amiR-OsAGO17*的序列，并转化大肠杆菌感受态，得pre-amiR-OsAGO17159的重组质粒，所述pre-amiR-OsAGO17159重组质粒的序列如SEQIDNo:7所示；(5)对pre-amiR-OsAGO17159质粒和pHB质粒进行酶切和酶接处理，并转化大肠杆菌感受态，得针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体。本专利技术的有益效果是：(1)人工microRNA干扰载体转入水稻体内后能稳定产生成熟的人工microRNA，amiR-OsAGO17。(2)amiR-OsAGO17能介导精确剪切OsAGO17基因的mRNA，有效导致OsAGO17的基因下调。附图说明图1为质粒的PCR扩增结果以及干扰载体的酶切鉴定结果；图2为OsAGO17基因amiRNA干扰载体的构建意图；图3为转基因水稻的PCR鉴定结果；图4为液相杂交检测转基因水稻植株中amiRNA的表达结果；图5为qRT-PCR定量检测转基因水稻植株中OsAGO17基因mRNA的表达量结果；图6为Westernblot检测转基因水稻植株中OsAGO17蛋白的表达量结果；图7为利用5’RLM-RACE鉴定amiR-OsAGO17靶基因的剪切位点结果；图8为转基因水稻与野生型水稻在种子成熟期的比较；图9为转基因水稻与野生型水稻稻穗的比较(白色箭头表示空壳种子)，Bar＝5cm；图10为转基因水稻与野生型水稻总谷子的比较；图11为转基因水稻与野生型水稻结实率的统计结果；图12为转基因水稻与野生型水稻花药的I2/KI染色结果；图13为转基因水稻与野生型水稻花粉粒的I2/KI和亚历山大染色，Bar＝200μm；图14为转基因水稻与野生型水稻花粉粒的I2/KI和亚历山大染色统计结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。实施例一：以水稻osa-miR159a前体为骨架的人工miRNA干扰载体的构建根据osa-miR159a序列，设计合成引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，所设计的引物序列分别为：pre-miR159a-F：5’-GTTGTGGACGTTGAGCTCCTTTC-3’(SEQIDNo:1)；pre-miR159a-R：5’-ACAAAAGATGCAGAGCTCCCTTC-3’(SEQIDNo:2)。然后以水稻DNA为模板，利用特异性引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，进行PCR扩增，扩增结果如图1A所示，获得一条272bp左右的特异条带，符合预测片段大小，该片段即为pre-miR159a片段。经测序验证结果表明该序列与osa-miR159a完全匹配，测序结果如下，其中下划线为miR159a/miR159a*序列：GTTGTGGACGTTGAGCTCCTTTCGGTCCAAAAAGGGGTGTTGCTGTGGGTCGATTGAGCTGCTGGGTCATGGATCCCGTTAGCCTACTCCATGTTCATCATTCAGCTCGAGATCTGAAAGAAACTACTCCAATTTATACTAATAGTATGTGTGTAGATAGGAAAATGATGGAGTACTCGTTGTTGGGATAGGCTTATGGCTTGCATGCCCCAGGAGCTGCATCAACCCTACATGGACCCTCTTTGGATTGAAGGGAGCTCTGCATCTTTTGT(SEQIDNo:3)。随后将获得的pre-miR159a片段进行回收，并与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态，最终得到含有miR159a前体pre-miR159a的重组质粒。利用在线amiRNA设计网站WMD3和RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体，其特征在于：所述干扰载体包括pre‑amiR‑OsAGO17

【技术特征摘要】
1.一种针对水稻OsAGO17基因的人工microRNA干扰载体，其特征在于：所述干扰载体包括pre-amiR-OsAGO17159序列，所述pre-amiR-OsAGO17159序列如SEQIDNo:7所示。2.如权利要求1所述的人工microRNA干扰载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据osa-miR159a序列，设计合成引物pre-miR159a-F和pre-miR159a-R，再以水稻DNA为模板进行PCR扩增，得pre-miR159a片段；所述pre-miR159a-F和pre-miR159a-R引物的序列分别如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示，所述pre-miR159a片段的序列如SEQIDNo:3所示；(2)针对水稻OsAGO17基因筛选特异性的amiRNA，并从中筛选出替代pre-miR159a中miR159a序列后仍能保持pre-miR159a原二级结构的amiRNA，所筛选出的amiRNA为amiR-OsAGO17，其序列如SEQIDNo:4所示；再根据amiR-OsAGO17的序列设计用于检测人工microRNA表达的带生物素标记的探针amiR-OsAGO17*，其序列如SEQIDNo:8所示；(3)根据p...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佛生，唐琳，徐莺，陈放，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51