利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法技术方案

本发明专利技术公开一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，以日本晴水稻品种为受体材料，其特征是利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行水稻Bsr‑d1基因的启动子区域距离起始密码子‑618位点的单碱基定点替换（A→G），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良的具有稻瘟病广谱抗性水稻种质材料。

Improvement of broad-spectrum resistance to rice blast by using CRISPR/Cas9-mediated adenine base editing system

The present invention discloses a method for improving broad-spectrum resistance to rice blast by using CRISPR/Cas9-mediated adenine base editing system. The method takes Japanese clear rice cultivars as recipient materials, and is characterized by using CRISPR/Cas9-mediated adenine base editing system to locate a single base at the promoter region of rice Bsr_d1 gene by Agrobacterium-mediated transformation. Replacement (A G), identification and screening of double allele mutant plants at the site after obtaining transgenic regenerated plants, and screening of negative progenies after self-fertilization, that is, improved rice germplasm materials with broad-spectrum blast resistance.

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法
：本专利技术农业生产
，具体涉及一农业生产的水稻种质资源生产领域，特别是一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法。
技术介绍
：水稻，是全世界最重要的粮食作物之一，在世界约一半人口是水稻作为口粮，稻瘟病是水稻主要病害之一，在业界被称为“水稻癌症”，可造成水稻大幅度减产，情况严重时，减产量可达30%～50%，甚至颗粒无收，据不完全统计全世界因稻瘟病而至水稻减产损失在1.6亿吨以上。因此提高水稻对稻瘟菌的抗性一直以来都是水稻抗病育种工作的重要问题。水稻对稻瘟病菌的抗性主要分为CRISPR/Cas9介导的抗性和非CRISPR/Cas9介导的抗性两种。CRISPR/Cas9介导的抗性，即利用水稻稻瘟病抗病（R）基因介导的对含有对应无毒基因的稻瘟菌生理小种所产生的抗性，这种抗性具有抗病效果强的特点，然而该抗性的局限在于范围狭窄且难以持久。由于稻瘟菌的毒性发生变异和优势小种的产生，通常抗病品种在推广3-5年后就丧失其抗性，也因此该抗性在农业生产上受到较大限制。非CRISPR/Cas9介导的抗性又称广谱抗性，能使水稻对几乎所有稻瘟病菌均具有良好的抗病效果，与CRISPR/Cas9介导的抗性相比具有不易被克服，田间效果持久的特点，具有更大应用价值。虽然人类在长期的农业生产中选择出少量具有广谱抗性的水稻材料，然而这类抗性背后的作用机制一直不清楚。最近，四川农业大学陈学伟教授课题组在Cell杂志发表研究论文，报道了利用广谱高抗水稻地谷与基因组已经测序的66份非广谱抗病水稻进行GWAS（全基因组关联）分析，并应用高抗水稻地谷与高感材料丽江新团黑谷为亲本构建的重组自交系，抗病性经多年田间自然诱发和苗期接种鉴定，进行共相关分析，鉴定到一个与广谱抗病表型高度关联单核苷酸替换SNP位点（A→G）（距离起始密码子-618），该位点位于一个编码C2H2类转录因子基因Bsr-d1（LOC_Os03g32230）的启动子区。围绕这一SNP位点巧妙地开展了一系列实验，揭示了该转录因子正调控下游过氧化物酶基因表达，以及上游受MYBS1转录因子负调控该C2H2转录因子表达的一条完整的调控途径。地谷与其它感病水稻品种相比，Bsr-d1启动子区域中的MYBS1结合位点存在差异，进而导致MYBS1对地谷Bsr-d1的启动子具有更强的结合能力。该研究成果揭示一个崭新的水稻免疫转录调控网络：稻瘟菌通过某种未知机制诱导水稻中Bsr-d1转录因子的表达，从而导致水稻体内过氧化物酶水平的升高，这将有助于清除由于宿主PTI通路激活所产生的H2O2累积，进而为稻瘟菌的侵染减小压力；而Bsr-d1的启动子区域发生突变使得Bsr-d1的负调控转录因子MYBS1对其拥有更强的结合能力，从而降低了Bsr-d1和其所调控的过氧化物酶的表达，促进了水稻在受到稻瘟菌侵染时H2O2的累积，提高水稻对稻瘟菌的广谱抗性。若应用到实际生产中，可培育具有广谱抗病能力的品种，将大幅度提高水稻对稻瘟病的抵抗力，并将有效避免病源菌进化导致的抗病能力失效的问题，有效减少农药使用，非常符合生态绿色环保的需求。且这一变异位点在提高抗病性的同时，对水稻产量性状和稻米品质没有明显影响，因而具有十分重要的应用价值。CRISPR/Cas9技术自诞生以来在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命，该技术已经广泛应用于包括农作物在内的各种生物体的基因组编辑。科学工作者利用该技术，创造了大量的植物内源基因功能缺失的突变体，为植物的功能基因组学研究和应用研究做出了巨大的贡献。然而，核苷酸点突变是作物许多重要农艺性状发生变异的遗传基础。大多数时候科学家希望通过引入单碱基突变造成氨基酸的变化达到基因功能的增强或减弱，而不是单纯地敲除基因功能。由于定向同源修复(HDR)的编辑效率低，CRISPR/Cas9介导的单碱基突变编辑系统的研究就十分必要。2016年，哈佛大学DavidLiu研究组开发了APOBEC1脱氨酶与dSpCas9的N末端融合的胞嘧啶编辑器CBE。神户大学AkihikoKondo研究组开发了胞苷脱氨酶（AID）直向同源物与dSpCas9的C末端融合的胞嘧啶编辑器CBE，该两个课题组首次在动物中实现了C-G到T-A的单碱基突变。随后，2017年，朱健康课题组首次在植物中运用APOBEC1-dCas9实现了CRISPR/Cas9介导的C-G到T-A的单碱基突变。2017年，哈佛大学DavidLiu研究组通过几轮定向进化和蛋白质工程将大肠杆菌一种tRNA腺苷脱氨酶TadA进化成能作用在DNA上的腺苷脱氨。然后，将改造后的TadA与nSpCas9切口酶融合成ABE，实现了将动物细胞内DNA中的A-T碱基转换为G-C碱基对。2018年,朱健康课题组又通过融合SpCas9(D10A)和ecTadA*7.10的方法实现了IPA1等基因的编辑，编辑效率最高达45.2%，成功开发了水稻中的腺嘌呤碱基编辑器，从而拓宽了植物中的基因组工程工具。该文首次证明了的腺嘌呤碱基编辑器可以在植物中有效地和CRISPR/Cas9介导的地将目标A-T转换成G-C。该研究没有在目标位点或潜在的脱靶位点上发现任何插入缺失或其他碱基转换或颠换的突变。这些特征表明了腺嘌呤碱基编辑系统优于HDR介导的序列替换。2018年，朱健康课题组再次利用SpCas9和SaCas9的变体开发了新的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器，通过使用切口酶VQR-Cas9（D10A）、VRER-Cas9（D10A）和SaKKH-Cas9(D10A)代替ABE/CBE-P1碱基编辑器中SpCas9（D10A）切口酶，分别产生新的碱基编辑器ABE/CBE-P3、ABE-P4和ABE/CBE-P5[25]。已有报道VQR-Cas9识别的PAM序列为NGA,而VRER-Cas9的PAM为NGCG序列，则SaKKH-Cas9的PAM是NNNRRT，这在很大程度上拓宽了碱基编辑器的应用范围，扩展了水稻基因组中的可靶向的CRISPR/Cas9介导的单碱基突变，故该研究报道对推进水稻的精确分子育种具有重要的现实意义。因此如何来利用日本晴水稻为受体材料，利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统，通过农杆菌介导转化进行稻瘟病感病水稻材料Bsr-d1基因的启动子区域距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（A→G），获得双等位突变植株后自交筛选转基因阴性后代，即可获得不携带转基因成份的稻瘟病广谱抗性改良新材料。该方法为快速精准地创制稻瘟病广谱抗性水稻种质资源开辟一条崭新的途径，将大大推动水稻稻瘟病抗病育种进程。保障水稻米的高产、稳产有着重要意义。
技术实现思路
：本专利技术针对现有技术存在的不足，提供一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法。以日本晴水稻品种为受体材料，利用CRISPR/Cas9介导的CRISPR/Cas9腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行Bsr-d1基因的启动子区域距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（A→G），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，以日本晴水稻品种为受体材料 ，其特征是利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行水稻

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，以日本晴水稻品种为受体材料，其特征是利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行水稻Bsr-d1基因的启动子区域距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（A→G），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良的具有稻瘟病广谱抗性水稻种质材料。2.根据权利要求1所述一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，其特征是包括如下方法步骤：（1）确定CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统作用靶位点，根据水稻品种日本晴的水稻Bsr-d1基因位点的启动子序列，确定水稻Bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(A)的下游邻近序列，在目标替换碱基下游设置2个不同的PAM1和PAM2，分别进行目标替换碱基的单碱基替换（A→G），其中PAM1的序列为ATAAGT，上游对应的包含目标替换碱基由20个碱基组成靶标序列为TTAAATTTTAACTGATAAAT；PAM2的序列为AGCG，上游对应的包含了目标替换碱基(A)由20个碱基组成靶标序列为AACTGATAAATATAAGTATA；其中所述PAM1由CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统ABE-P5系统识别，所述PAM2是由CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统ABE-P4系统识别；（2）构建CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，按照（1）步的靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻Bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(A)打靶的CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，所述CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框以及Cas9核酸酶与tRNA腺苷脱氨酶TadA基因融合的表达框；（3）遗传转化，利用农杆菌介导转化法将已构建好的CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转入受体水稻品种日本晴，获得不少于200株独立转化植株；（4）筛选并检测单碱基替换突变体植株，CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在单碱基替换靶位点侧翼引物扩增转基因植株，而后送样PCR产物和T载体克隆质粒进行测序，最后筛选并检测出完成单碱基替换突变体植株；（5）筛选具有广谱稻瘟病抗性改良水稻，选择步骤（4）已实现单碱基替换突变体植株即纯合突变T0再生株系，种植结实收获T1代种子，根据Cas9基因引物和潮霉素基因序列引物筛选出T1代转基因阴性植株，为不携带任何转基因成分的具有广谱稻瘟病抗性改良水稻。3.根据权利要求2所述的一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，其特征是步骤（2）所述构建CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，包括如下方法，A）、在目标替换碱基下游找到合适的PAM位置，选择PAM上游的20个碱基作为靶标序列；B）、根据20个碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈春修，
申请(专利权)人：宜春学院，
类型：发明
国别省市：江西,36