一种双光子甲醛荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了检测细胞和组织中的甲醛的荧光探针，所述荧光探针Co‑FA，其化学结构式如下。本发明专利技术还公开了所述该荧光探针的制备方法和其在检测环境和生物样本中的甲醛的应用。本发明专利技术的探针随甲醛含量的增加荧光强度显著降低，利用本发明专利技术的探针通过荧光成像技术可检测细胞内甲醛的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种双光子甲醛荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种检测细胞内甲醛的荧光探针及其应用，属于有机小分子荧光探针领域。
技术介绍
甲醛是一种无色、有强烈刺激性气味的气体。易溶于水、醇和醚。甲醛在常温下是气态,通常以水溶液形式出现,是一种公认的致癌物质。甲醛可通过各种自然的和人为的活动产生。如燃料燃烧、工业生产、微生物的排放。甲醛是原浆毒物,能与蛋白质结合,高浓度甲醛能对人的眼睛、鼻、呼吸道和皮肤等易暴露器官产生伤害。甲醛检测方法主要有分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法、传感器法等。但每种检测方法所偏重的应用领域不同,并各有其优点和一定的局限性。因此,专利技术一种能快速、方便检测生物样品中甲醛的荧光探针可能对与甲醛相关的疾病研究有重要的实际意义。小分子有机荧光探针是一种将分子间的相互作用转换为光学信号传递给外界的工具。因其具有高选择性,高的检测灵敏度、并能实时在线检测等优点而备受关注。被广泛用于生物医学、环境科学等领域。它与特定目标分析物发生作用后,荧光信号会发生变化,以达到检测目的。因此,我们设计了一种基于cope重排反应的荧光探针,从而实现对甲醛的特异性检测。目前针对甲醛识别的小分子荧光探针报道的并不多，尤其是识别活组织中的中甲醛的荧光探针更是少之又少。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种甲醛荧光探针(Co-FA)及其应用。利用本专利技术的探针通过荧光成像技术检测细胞中的甲醛，可用于评价和研究细胞内的甲醛的生理功能。一种检测甲醛的双光子荧光探针Co-FA，Co-FA的分子式为：。上述双光子荧光探针Co-FA的制备方法，按照以下骤进行：在反应容器中加入7-羟基-8-甲酰基-3-乙酯基香豆素（1），烯丙基三氟硼酸钾（2），氨水（3）和甲醇，室温反应10h以上，生成化合物Co-FA，真空干燥，得淡黄色固体Co-FA，具体反应方程如下：。其中，7-羟基-8-甲酰基-3-乙酯基香豆素，烯丙基三氟硼酸钾，氨水摩尔比为1:1:10，7-羟基-8-甲酰基-3-乙酯基香豆素与甲醇的剂量比为1mmol：10ml。上述双光子荧光探针Co-FA的应用，其特征在于，用于检测甲醛。具体的，应用于检测环境中和生物样本中的甲醛。对生物样本和环境中甲醛的检测方法为，双光子荧光探针Co-FA与甲醛反应，荧光猝灭，随着甲醛浓度的增加，反应体系荧光强度逐渐降低。上述检测方法中，双光子荧光探针Co-FA激发光为410nm，发射光为500nm。本专利技术所述检测甲醛的双光子荧光探针Co-FA本身具有强的发射荧光，当探针与甲醛分子作用后，化合物Co-FA与甲醛发生2-aza-cope重排反应生成7-羟基-8-甲酰基-3-乙酯基香豆素（1），使探针的荧光淬灭。识别机理如下：。本专利技术提供的甲醛荧光探针属小分子类荧光探针，实验证实，本专利技术提供的检测甲醛的荧光探针溶液，当向其加入甲醛后荧光显著降低，该结果及其现象为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。相应的，利用本专利技术的探针通过荧光成像技术检测甲醛可于评价和研究细胞内甲醛的含量和生理功能，尤其是其还可以检测活组织内的甲醛，对研究获得生物样品中甲醛的生理功能有潜在的应用价值。有益效果（1）响应速度快，100min左右即可观察反应体系荧光强度即可得到样品中甲醛浓度；（2）探针与甲醛反应当量大，最大可检测饱和当量为100eq；（3）抗干扰能力强；（4）合成方法简便易操作。附图说明图1：探针Co-FA的核磁谱图（氢谱）；图2：探针Co-FA在水相中的选择性。其中激发波长为410nm；探针的浓度：5µM，选择性离子（或氨基酸）的浓度为2.5mM，活性氧（或者活性氮）浓度为100μM，醛酮浓度为40μM；1-26加入的离子分别为：探针、叔丁基过氧化氢、亚硫酸氢钠、硫化钠、硫酸钠、硫酸亚铁、溴化钠、次氯酸钠、过氧化氢、亚硝酸钠、、半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、一氧化氮、葡萄糖、2，4-二硝基苯、丙酮酸钠、乙醛、三氯乙醛、乙二醛、甲醛；图3：探针Co-FA与甲醛作用的滴定实验。其中激发波长为410nm；探针的浓度：5µM；图4：探针Co-FA与甲醛作用的动力学实验。其中激发波长为410nm；探针的浓度：5µM。甲醛的浓度为2.5和5mM，测试时间：160min；图5.探针Co-FA在HeLa细胞中的成像结果。a.明场细胞；b.加入5μM探针孵育30min后的荧光场；c.a与b的叠加场。d.明场细胞；e.加入5μM探针孵育30min后，用PBS洗三遍，再加入50μM的甲醛水溶液继续孵育30min后的荧光场；f.d与e的叠加场。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物的号码。实施例1:化合物Co-FA的合成：在100mL圆底烧瓶中，加入2.62g7-羟基-8-甲酰基-3-乙酯基香豆素(1)，1.47g烯丙基三氟硼酸钾(2)，0.5mL氨水（3）再加入5mL甲醇，室温反应生成化合物Co-FA，真空干燥，得淡黄色固体Co-FA。产率：71%。实施例2:化合物Co-FA甲醛荧光探针对不同分子或离子的选择性配制5mL浓度为40mM的各种常规的离子及氨基酸的PBS水溶液及浓度为1mM的本专利技术所述检测甲醛的荧光探针Co-FA母液作为备用。加入25μL探针母液、225μLDMSO和500当量的各离子(或氨基酸)溶液，用磷酸缓冲液PBS定容至5mL，摇匀后进行荧光检测（λex=410nm,λem=500nm），建立荧光强度与各离子(或氨基酸、活性氧、活性氮)的曲线图(结果见图2)。30min后检测溶液的荧光发射光谱变化，由图2可以发现，其他离子(或氨基酸)对化合物Co-FA的荧光几乎没有影响，而甲醛的加入使化合物Co-FA的荧光淬灭。实施例3：不同浓度的甲醛对探针Co-FA的荧光滴定检测配制10mL浓度为100mM甲醛的水溶液及浓度为1mM的本专利技术所述检测甲醛的荧光探针Co-FA母液作为备用。配制探针浓度为5μM，分别与不同浓度的甲醛（0-5mM）相互作用，并进行荧光检测（λex=410nm,λem=500nm），计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与甲醛浓度标准曲线。如图3所示，随着甲醛浓度的增加，反应体系荧光强度逐渐降低，当甲醛浓度达到5mM时，反应体系荧光强度降到饱和状态。实施例4：探针Co-FA与甲醛相互作用的动力学测试配制10mL浓度为100mM甲醛的水溶液及浓度为1mM的本专利技术所述检测甲醛的荧光探针Co-FA母液作为备用。配制探针Co-FA和甲醛的溶液，其浓度分别为：探针5μM；甲醛浓度：2.5和5mM。进行荧光检测（λex=410nm,λem=500nm），每隔5min测试一次，测试160min，计算各体系中随时间变化的荧光强度，建立荧光强度与作用时间标准曲线。如图4所示，大约反应100min，反应体系荧光强度达到饱和状态。实施例5：探针Co-FA在细胞中对甲醛的成像测试配置1mL浓度为5μM的探针PBS溶液，然后加入到HeLa细胞中孵育30min成像；另一组是将1mL浓度为5μM的探针PBS溶液加入到HeLa细胞中孵育30min后加入50μM的甲醛水溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测甲醛的双光子荧光探针Co‑FA，其特征在于，Co‑FA的分子式为：

【技术特征摘要】
1.一种检测甲醛的双光子荧光探针Co-FA，其特征在于，Co-FA的分子式为：。2.一种权利要求1所述的双光子荧光探针Co-FA的制备方法，其特征在于，按照以下骤进行：在反应容器中加入7-羟基-8-甲酰基-3-乙酯基香豆素（1），烯丙基三氟硼酸钾（2），氨水（3）和甲醇，室温反应10h以上，生成化合物Co-FA，真空干燥，得淡黄色固体Co-FA，具体反应方程如下：。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，7-羟基-8-甲酰基-3-乙酯基香豆素，烯丙基三氟硼酸钾，氨水摩尔比为1:1:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，孔秀琪，李敏，董宝利，张楠，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37