一种多聚糖基纳米粒子造影剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种多聚糖基纳米粒子造影剂及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：步骤一，将葡聚糖溶于水制备得到葡聚糖水溶液，浓度为10‑50mg/mL；步骤二，将引发剂硝酸铈铵溶于硝酸制备得到引发剂水溶液；步骤三，将水溶性交联剂N,N‑亚甲基双丙烯酰胺溶于水制备得到交联剂水溶液；步骤四，在惰性气体保护下，向所述葡聚糖水溶液中加入所述引发剂水溶液引发自由基。可以有效的避免造影剂进入血管，降低了MR示踪剂的背景噪声，提高了淋巴通路示踪的特异性和示踪的时限性。

A polysaccharide-based nanoparticle contrast agent and its preparation method

The invention discloses a polysaccharide-based nanoparticle contrast agent and a preparation method thereof. The preparation method comprises the following steps: first, preparing Dextran Aqueous Solution by dissolving dextran in water with a concentration of 10_50mg/mL; second, preparing initiator aqueous solution by dissolving cerium ammonium nitrate in nitric acid; third, preparing initiator aqueous solution by dissolving water-soluble crosslinker N, N_methylene bisacrylamide; The crosslinking agent aqueous solution is prepared by dissolving in water; step 4, free radicals are initiated by adding the initiator aqueous solution to the dextran aqueous solution under the protection of inert gas. It can effectively avoid the contrast agent entering the blood vessel, reduce the background noise of MR tracer, improve the specificity of lymphatic pathway tracing and the time limit of tracing.

【技术实现步骤摘要】
一种多聚糖基纳米粒子造影剂及其制备方法
本专利技术涉及医药学造影剂领域，更确切地说是一种多聚糖基纳米粒子造影剂及其制备方法。
技术介绍
近年来临床淋巴水肿的治疗发展较慢，主要原因之一是缺乏理想的淋巴系统检查方法。采用同位素造影剂的淋巴闪烁造影的分辨率低，难以清晰地显现淋巴结和淋巴管的形态和结构。注射碘油的直接淋巴造影虽然对淋巴管和淋巴结有较高的分辨率，但因可能发生肺栓塞等严重并发症和检查本身对淋巴管造成的刨伤已基本被弃用，且以上两种检查都不能对淋巴系统作动态性的观察。20世纪90年代磁共振成像(MRI)被用于淋巴循环障碍疾病的诊断，其优点是高分辨率能生成清晰的淋巴系统三维图像且无放射性。近期陆续有MR淋巴造影诊断淋巴系统的恶性肿瘤的研究报道，其中多为静脉注射造影剂。我们自2007年10月至2008年10月采用皮内注射钆贝葡胺MR淋巴造影对30例慢性肢体淋巴水肿进行检查，为诊断淋巴循环障碍疾病提供了形态和功能兼备的方法。淋巴系统除了发挥其正常的生理作用外，也为肿瘤的转移提供了便利。肿瘤发生淋巴道转移时，最早接触扩散的肿瘤细胞的一批淋巴结称为前哨淋巴结(SLNs)。如果前哨淋巴结没有检出肿瘤转移灶，则远处其他的淋巴结出现转移病灶的概率很低。所以前哨淋巴结的活检可以帮助临床医生评估淋巴结状态并制定有效的治疗计划，而准确的SLN示踪则是实现SLN活检的必要先决条件。目前临床常用蓝色染料法以及使用放射性核素进行的淋巴闪烁显像法或者是综合利用以上这两者来进行SLN显影。比如局部注射99mTc标记的的胶质和/或活体染料，之后利用核医学设备或直视下判断SLN的位置。但这些方法有其固有的缺点：蓝色染料只能帮助医生在直视下定位淋巴结，无法用于术前定位。另外，其分子量小扩散速度快且在体内分布无选择性，可能会使得区分SLN与第二甚至第三级淋巴结变得困难，还有可能污染手术视野。淋巴闪烁显像的敏感性高但空间分辨率很低，而且使用放射核素会导致患者、医护人员等的辐射暴露及潜在的安全问题。另外，核素的使用和制备还需要复杂的设备，在许多场所中无法进行。相比之下，MRI作为一种能提供术前定位的非侵入性检查手段，而且其对于软组织有很强的空间分辨率和敏感性。MRI对比剂主要包括以钆剂(Gd)以及超顺磁性氧化铁(SPIO)为代表的两大类，分别为T1对比阳性增强剂和T2对比阴性增强剂。相比而言，前者更为经济，而且后者作为阴性对比剂无法显影淋巴管。然而临床常用的钆对比剂是低分子量的钆螯合物，例如DTPA-Gd等。由于其分子量小，无选择性，在体内消除较快，导致其背景噪声大，显影窗口短，另外由于弛豫率低，剂量需求大，有引起慢性肾病等远期毒性反应的风险。许多不同的载体被创造出来包裹及运输钆螯合物，包括高分子囊泡、树突状高分子、脂质体或微胶粒。在这些例子中，有些展现了很好的MRI敏感性，例如钆修饰的脂质体或微胶粒；有些成功延长了其在循环系统中的存活时间，以此扩大了显影窗口，例如接载钆的树突状大分子。然而目前大部分钆的载体，诸如脂质体和微胶粒，在生物环境中的稳定性欠佳，而诸如接载钆的树突状大分子这类载体的应用则因为其排泄较慢可能导致有毒金属离子从螯合物释放而出导致毒性反应而受限。因此目前仍有研制生物安全性高且能有选择性地显影SLN的MRI对比剂的必要。纳米粒子由于粒径小，有较大的比表面积方便钆剂负载，而用纳米载体负载钆螯合物后会帮助提升其作为MRI对比剂的弛豫值，提高显影效率，降低显影所需剂量。同时，应用自组装一步法制备纳米颗粒其粒径是可以调控的，这也有助于制备粒径适合靶向进入淋巴管的纳米颗粒，增加纳米颗粒选择性积聚于SLN的可能性。多糖是一类具有良好生物相容性的天然大分子，在自然界中广泛易得且可降解，具有羟基或氨基等官能团，可以进行化学改性或进一步修饰，备受研究者青睐。通过多糖可以制备得到多种纳米粒子，具有良好的生物相容性、生物降解性以及其他生物功能，使之成为制造含钆纳米核磁共振对比剂粒子的良好前体。目前存在的钆-葡聚糖基纳米凝胶仅用于正常淋巴结的检测的诊断，并未在恶性肿瘤前哨淋巴结活检显像与定位方面进行应用，并且钆-葡聚糖基纳米凝胶制备方法并无详细操作步骤和具体配备剂量的说明，而且在前哨淋巴结活检方面目前并无应用的报道和研究。
技术实现思路
本专利技术的目的本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种钆-多聚糖基纳米粒子在制备淋巴水肿的淋巴通路核磁共振示踪剂的应用。本专利技术采用以下技术方案：多聚糖基纳米粒子造影剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：步骤一，将葡聚糖溶于水制备得到葡聚糖水溶液，浓度为10-50mg/mL；步骤二，将引发剂硝酸铈铵溶于硝酸制备得到引发剂水溶液；步骤三，将水溶性交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于水制备得到交联剂水溶液；步骤四，在惰性气体保护下，向所述葡聚糖水溶液中加入所述引发剂水溶液引发自由基，均匀搅拌，调节pH值为酸性，反应5min，然后加入所述丙烯酸单体，反应30min，形成接枝共聚物，然后加入所述交联剂水溶液，反应4-24h，然后进行透析或离心除去未反应的葡聚糖、单体及交联剂，得到多聚糖基丙烯酸纳米载体水溶液；步骤五，将所述多聚糖基聚丙烯酸纳米载体水溶液，在恒温条件下，逐滴滴加小分子钆螯合物或者荧光分子，常温下搅拌，避光反应24-48h，反应结束后透析纯化，最后得到多糖基纳米粒子造影剂。步骤四中所述多聚糖基聚丙烯酸纳米载体具有交联结构。多聚糖基纳米造影剂的粒径可通过单体丙烯酸的比例、葡聚糖的分子量及比例、及交联剂的比例来调控，最终使造影剂的粒径在50-300nm范围内。制备得到多聚糖基纳米MRI显影剂的纵向弛豫率是商业钆喷酸葡胺注射液纵向弛豫率的5-25倍。步骤五中所述钆螯合物为二乙烯三胺五乙酸钆、乙二氨四乙酸钆、1,2-环已二胺四乙酸钆、三乙烯四胺六乙酸钆、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸钆、2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二-1-基]乙酸钆、10-(2-羟基丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸钆、硫酸钆、硝酸钆、碳酸钆、三(四甲基环戊二烯)钆、三(环戊二烯)化钆、草酸钆和三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)钆中的任一种。步骤五中所述荧光分子包括FITC、Cy系列荧光分子、尼罗红中的任一种。本专利技术的优点是：可以有效的避免造影剂进入血管，降低了MR示踪剂的背景噪声，提高了淋巴通路示踪的特异性和示踪的时限性，同时又提高的MR对比剂的弛豫率，有效的降低了MR示踪剂产生的生物毒性。附图说明下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细说明，其中：图1是本专利技术的结构示意图。图2是本专利技术的产品结构图谱，其中：A：氢谱BC：未负载钆纳米粒子电镜图及平均粒径DE：负载钆纳米粒子电镜图及平均粒径FG：负载钆纳米粒子弛豫值。图3是本专利技术体内效果验证实验结果，A：纳米粒子体内显影SLNB-D：美兰验证SLN位置，确认核磁显影准确性。图4是本专利技术的显影效果随时间变化图。图5是本专利技术中AB：MTT法测量发现其对人体细胞增殖无明显影响；CD：透射电镜发现其在细胞内经由溶酶体分解代谢图。图6是本专利技术对大鼠体重、行为、血生化指标、主要脏器细胞形态等无明显影响图，其中，A：对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多聚糖基纳米粒子造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤一，将葡聚糖溶于水制备得到葡聚糖水溶液，浓度为10‑50mg/mL；步骤二，将引发剂硝酸铈铵溶于硝酸制备得到引发剂水溶液；步骤三，将水溶性交联剂N,N‑亚甲基双丙烯酰胺溶于水制备得到交联剂水溶液；步骤四，在惰性气体保护下，向所述葡聚糖水溶液中加入所述引发剂水溶液引发自由基，均匀搅拌，调节pH值为酸性，反应5min，然后加入所述丙烯酸单体，反应30min，形成接枝共聚物，然后加入所述交联剂水溶液，反应4‑24h，然后进行透析或离心除去未反应的葡聚糖、单体及交联剂，得到多聚糖基丙烯酸纳米载体水溶液；步骤五，将所述多聚糖基聚丙烯酸纳米载体水溶液，在恒温条件下，逐滴滴加小分子钆螯合物或者荧光分子，常温下搅拌，避光反应24‑48h，反应结束后透析纯化，最后得到多糖基纳米粒子造影剂。

【技术特征摘要】
1.多聚糖基纳米粒子造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤一，将葡聚糖溶于水制备得到葡聚糖水溶液，浓度为10-50mg/mL；步骤二，将引发剂硝酸铈铵溶于硝酸制备得到引发剂水溶液；步骤三，将水溶性交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于水制备得到交联剂水溶液；步骤四，在惰性气体保护下，向所述葡聚糖水溶液中加入所述引发剂水溶液引发自由基，均匀搅拌，调节pH值为酸性，反应5min，然后加入所述丙烯酸单体，反应30min，形成接枝共聚物，然后加入所述交联剂水溶液，反应4-24h，然后进行透析或离心除去未反应的葡聚糖、单体及交联剂，得到多聚糖基丙烯酸纳米载体水溶液；步骤五，将所述多聚糖基聚丙烯酸纳米载体水溶液，在恒温条件下，逐滴滴加小分子钆螯合物或者荧光分子，常温下搅拌，避光反应24-48h，反应结束后透析纯化，最后得到多糖基纳米粒子造影剂。2.如权利要求1所述的多聚糖基纳米造影剂的制备方法，其特征在于，步骤四中所述多聚糖基聚丙烯酸纳米载体具有交联结构。3.如权利要求1所述的多聚糖基纳米造影剂的制备方法，其特征在于，多聚糖基纳米造影剂的粒径可通过单体丙烯酸的比例、葡聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴婷婷，窦红静，李圣利，李青峰，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31