基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法技术方案

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法。本发明专利技术构建了一个陆地棉的转化载体，利用这个载体在陆地棉基因组中进行高通量编辑的应用。本发明专利技术通过带有接头的引物克隆得到tRNA和CcdB基因片段，将这些基因片段连接至适用于陆地棉基因组编辑的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ转化载体中成为一种可以高通量编辑棉花基因组的载体Htkt。本发明专利技术利用高通量转化载体的特点，可大批量设计陆地棉靶标片段并进行混合构建载体最终得到棉花突变体库。高通量测序结果表明，这种高通量载体的sgRNA覆盖率高达97％。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法构建得到陆地棉的一个高通量转化载体，利用这个载体可以在陆地棉基因组中进行高通量编辑的应用。
技术介绍
基因突变是研究基因功能的常用方法之一，从EMS突变，辐射诱变，T-DNA插入，转座子插入等随机突变方法，到锌指核酸酶(ZFN)与类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)目标基因定点修饰技术，是生物
的一次突破。CRISPR是指一段具有成簇的规律间隔的短回文重复序列，通过CRISPR系统将目标序列切断后，生物个体会启动自身的修复机制，包括非同源重组修复和同源重组修复，在修复后产生插入、缺失等突变，导致目标基因功能沉默。CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过guideRNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑，CRISPR系统可以靶向任何含5’-N20-NGG-3’(N＝A，T，G，C)或5’-CCN-N20-3’的DNA序列，其中NGG为Cas9识别所需的PAM，并且在PAM前3bp左右的位置精确的切割靶DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的高通量载体Htkt，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的高通量载体Htkt，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：5所示。2.一种基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的载体Htkt的方法，其特征在于以下步骤：(1)用带有接头的引物以PGTR4载体为模板扩增tRNA，PGTR4载体核苷酸序列如SEQIDNO：6所示，扩增出的tRNA核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；(2)用带有接头的引物从PK2GW7.0载体中扩增CcdB，PK2GW7.0载体核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，扩增出的CcdB核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；(3)以步骤(1)、步骤(2)所得的产物为模板进行PCR并拼接成tRNA-CcdB，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；(4)用限制性酶Bsa1酶切核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，与步骤(3)的拼接的产物进行连接，热击到DB3.1大肠杆菌感受态，用引物U6-7S进行测序，得到核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的高通量棉花突变体库的载体Htkt；其中：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭小平，徐孝兰，张军，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42