一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法技术

本发明专利技术涉及一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，利用交叠PCR技术获得了上下游同源臂的融合片段，采用混合孵育的方式完成了重组质粒的转化，并利用二次同源重组技术有效敲除了鳗弧菌的鞭毛蛋白FlaB。本发明专利技术简单易行，极大的提高了基因敲除的效率，为鳗弧菌的基因敲除提供了技术支持，同时也为鞭毛蛋白的生物学功能研究提供新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法
本专利技术属于微生物基因工程领域，特别涉及一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法。
技术介绍
鳗弧菌属于革兰氏阴性菌，其广泛的存在于我国沿海水体和淤泥中，并且经常粘附在海洋生物的体表和肠道中，是水产养殖中常见的一类致病菌，能引起鱼类肠道粘膜脱落、肝脏坏死、体表溃烂、鳃丝出血、粘液增多等症状。有研究报道指出，我国海水养殖大黄鱼、鲈鱼、牙鲆、大菱鲆等海水鱼类受鳗弧菌感染严重，且经常导致虾类黄鳃病的发生，所以其危害性非常大。因为鳗弧菌病具有死亡率高、感染范围广、传播速度快等特点，因此经常给我国的海水养殖产业带来巨大的经济损失。鞭毛是细菌体表重要的细胞器和附属结构，呈弯曲波浪状形态，是细菌独有的运动器官。最初，鞭毛被简单的认为仅仅是细菌的运动器官，但是随着对鞭毛结构和功能研究的不断深入，人们发现鞭毛的运动性可以帮助细菌侵入宿主细胞，并且鞭毛介导的粘附在致病菌定值易感鱼群的过程中起着关键性作用。除此之外，鞭毛也是鱼类宿主先天性免疫应答的诱导剂，能够诱发严重的免疫反应，所以鞭毛在细菌的致病过程亦发挥着重要作用，可以通过与寄主细胞上的免疫受体结合而诱发炎症。研究发现，鳗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，包括：(1)采用交叠PCR技术获得鞭毛蛋白FlaB上下游同源臂的融合片段；(2)利用重组酶Exnase II将融合片段与自杀载体pLP12进行重组，构建重组自杀质粒pLP12‑FlaB；(3)以大肠杆菌β2163作为重组自杀质粒的供体菌，以鳗弧菌作为受体菌，采用混合孵育完成重组自杀质粒pLP12‑FlaB的转化；(4)运用二次同源重组技术敲除鳗弧菌的FlaB基因，即可。

【技术特征摘要】
1.一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，包括：(1)采用交叠PCR技术获得鞭毛蛋白FlaB上下游同源臂的融合片段；(2)利用重组酶ExnaseII将融合片段与自杀载体pLP12进行重组，构建重组自杀质粒pLP12-FlaB；(3)以大肠杆菌β2163作为重组自杀质粒的供体菌，以鳗弧菌作为受体菌，采用混合孵育完成重组自杀质粒pLP12-FlaB的转化；(4)运用二次同源重组技术敲除鳗弧菌的FlaB基因，即可。2.根据权利要求1所述的一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的上游同源臂扩增引物的碱基序列如下：FlaB-MF1：GGAATCTAGACCTTGAGTCGAAGAATCGGTTGCCATTGTTGA；FlaB-MR1：GATGGTGACTGCTTCGCCTGCATTGCAGACACGTTAGTGCTTACA；下游同源臂扩增引物的碱基序列如下：FlaB-MF2：TGTAAGCACTAACGTGTCTGCAATGCAGGCGAAGCAGTCACCATC；FlaB-MR2：ACAGCTAGCGACGATAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：高权新，彭士明，闵明华，岳彦峰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31